カポシの肉腫関連ヘルペスウイルス核出口複合体の相互作用：ORF69は、細胞膜をリモデリングするための強力な要因です

すべてのヘルペスウイルスは、核からの組み立てられたカプシドの出口を一緒に促進する核出口錯体（NEC）と呼ばれる2つのタンパク質の複合体をコードします。以前、我々は、タンパク質発現のためにバキュロウイルスを使用して昆虫細胞で発現した場合、ORF67およびORF69遺伝子によって指定されたカポシの肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）NECが核膜で複合体を形成し、これらの膜を改造して核膜由来のベシクルを生成するためにこれらの膜を改造することを示しました。。この研究では、KSHV NECタンパク質の機能的ドメインとそれらの相互作用を分析しました。ガンマヘルペスウイルス保存残基の部位指向変異誘発により、これら2つのタンパク質の機能的ドメインが明らかになり、多くの場合、NECの形成と核膜の改造が廃止されました。すべての場合におけるORF67内の小さなインフレーム欠失は、変異タンパク質が細胞膜の増殖を誘導し、ORF69と相互作用する能力を失います。核周囲空間に存在するORF67のC末端の切り捨ては、ORF67の機能を損なうことはありません。ただし、ORF67の膜貫通ドメインの欠失は、膜の増殖を誘発することはできないが、核のORF69と相互作用することができ、野生型メンブレン融解ORF67との相互作用により核膜につながることができるタンパク質を生成します。ORF69のフレーム内の欠失は、NEC形成にさまざまな影響を及ぼしますが、すべて核膜の循環構造へのリモデリングを廃止します。1つの変異体は、野生型タンパク質と同様にORF67と相互作用しますが、円形小胞を生成する膜曲率および核分裂イベントでは機能できません。これらの研究は、ORF67が細胞膜の増殖に必要であり、ORF69がこれらの重複膜を円形ウリオンサイズの小胞に改造するために必要な因子であることを遺伝的に確認しています。さらに、Epstein-Barrウイルス（EBV）によってコードされたNECも調査しました。BFRF1およびBFLF2で構成されるEBV複合体は、自己蛍光タンパク質融合を使用して核膜で視覚化されました。BFRF1は、膜増殖の強力な誘導剤です。ただし、BFLF2はこれらの膜を円形構造に改造することはできません。明らかなのは、BFRF1によって誘発された宿主膜増殖を円形構造に変換できるORF69の優れたリモデリング活性です。

All herpesviruses encode a complex of two proteins, referred to as the nuclear egress complex (NEC), which together facilitate the exit of assembled capsids from the nucleus. Previously, we showed that the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) NEC specified by the ORF67 and ORF69 genes when expressed in insect cells using baculoviruses for protein expression forms a complex at the nuclear membrane and remodels these membranes to generate nuclear membrane-derived vesicles. In this study, we have analyzed the functional domains of the KSHV NEC proteins and their interactions. Site-directed mutagenesis of gammaherpesvirus conserved residues revealed functional domains of these two proteins, which in many cases abolish the formation of the NEC and remodeling of nuclear membranes. Small in-frame deletions within ORF67 in all cases result in loss of the ability of the mutant protein to induce cellular membrane proliferation as well as to interact with ORF69. Truncation of the C terminus of ORF67 that resides in the perinuclear space does not impair the functions of ORF67; however, deletion of the transmembrane domain of ORF67 produces a protein that cannot induce membrane proliferation but can still interact with ORF69 in the nucleus and can be tethered to the nuclear membrane by virtue of its interaction with the wild-type-membrane-anchored ORF67. In-frame deletions in ORF69 have varied effects on NEC formation, but all abolish remodeling of nuclear membranes into circular structures. One mutant interacts with ORF67 as well as the wild-type protein but cannot function in membrane curvature and fission events that generate circular vesicles. These studies genetically confirm that ORF67 is required for cellular membrane proliferation and that ORF69 is the factor required to remodel these duplicated membranes into circular-virion-size vesicles. Furthermore, we also investigated the NEC encoded by Epstein-Barr virus (EBV). The EBV complex comprised of BFRF1 and BFLF2 was visualized at the nuclear membrane using autofluorescent protein fusions. BFRF1 is a potent inducer of membrane proliferation; however, BFLF2 cannot remodel these membranes into circular structures. What was evident is the superior remodeling activity of ORF69, which could convert the host membrane proliferations induced by BFRF1 into circular structures.