抗メタスティックおよび発達シグナル伝達タンパク質であるPUFは、組織特異的近位調節要素（Pre）を介してアルツハイマー病のアミロイド-β前駆体タンパク質と相互作用します

背景：アルツハイマー病（AD）は、アミロイド-β（Aβ）ペプチドに密接に結びついています。主にAβ凝集体で構成される外膜外脳プラークは、ADの特徴です。本来のAβサブユニットは、疾患の進行に強く関与しています。Aβ前駆体タンパク質（APP）のタンパク質配列変異は、AD症例のごく一部を占めており、関連する遺伝子（APP）の調節がADエチオロジーにおいてより重要な役割を果たす可能性があることを示唆しています。APPプロモーターは、細胞型の特異性を付与する+1転写開始部位から、新しい30ヌクレオチド配列、または-76/-47で「近位調節要素」（pre）を持っています。この事前には、エピジェネティックな修飾に対して脆弱になるシーケンスが含まれており、薬物研究の実行可能な標的を提示する可能性があります。ゲル電気泳動モビリティシフトアッセイ（EMSA）およびプレミュータントEMSAによる核前タンパク質相互作用を調べました。これに続いて、プレミュータント/レポーター遺伝子融合クローンの機能的研究が続きました。 結果：PreでプローブされたEMSAは、複数の核抽出物および組織型特異的な方法でのヒト脳組織核抽出物におけるDNAタンパク質相互作用を示しました。競合ゲルシフトとゲルスーシフト：活性化タンパク質2（AP2）、NM23ヌクレオシド二リン酸キナーゼ/転移性阻害タンパク質（PUF）、および特異性タンパク質1（SP1）を使用して、プレに結合する可能性のある転写因子を特定しました。これらの部位は、既知の単一ヌクレオチド多型（SNP）を通過しました。プレミュータントとプロモーター/レポータークローントランスフェクション分析を伴うEMSAは、細胞と抽出物にさらにPUFを含みました。変異体/レポータークローントランスフェクションの機能的アッセイは、レポータータンパク質レベルのELISAによって評価されました。EMSAとELISAの結果は、メタ分析と相関しています。 結論：PUFはAPP遺伝子プロモーターを調節する可能性があり、PREでのPUF規制との干渉によりADリスクが増加する可能性があることを提案します。PUFは、カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII阻害剤1を標的としており、これもインテグリンと相互作用します。これらのタンパク質は、重要な細胞および神経学的機能に接続されています。さらに、転写因子PUFは転移の既知の阻害剤であり、発達中の細胞の成長を調節します。APPは既知の細胞接着タンパク質とフェロキシダーゼであることを考えると、これは細胞シグナル伝達、細胞周期、癌の鉄代謝、および全体的な老化の文脈におけるAD間の生化学的リンクを示唆しています。

BACKGROUND: Alzheimer's disease (AD) is intimately tied to amyloid-β (Aβ) peptide. Extraneuronal brain plaques consisting primarily of Aβ aggregates are a hallmark of AD. Intraneuronal Aβ subunits are strongly implicated in disease progression. Protein sequence mutations of the Aβ precursor protein (APP) account for a small proportion of AD cases, suggesting that regulation of the associated gene (APP) may play a more important role in AD etiology. The APP promoter possesses a novel 30 nucleotide sequence, or "proximal regulatory element" (PRE), at -76/-47, from the +1 transcription start site that confers cell type specificity. This PRE contains sequences that make it vulnerable to epigenetic modification and may present a viable target for drug studies. We examined PRE-nuclear protein interaction by gel electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and PRE mutant EMSA. This was followed by functional studies of PRE mutant/reporter gene fusion clones. RESULTS: EMSA probed with the PRE showed DNA-protein interaction in multiple nuclear extracts and in human brain tissue nuclear extract in a tissue-type specific manner. We identified transcription factors that are likely to bind the PRE, using competition gel shift and gel supershift: Activator protein 2 (AP2), nm23 nucleoside diphosphate kinase/metastatic inhibitory protein (PuF), and specificity protein 1 (SP1). These sites crossed a known single nucleotide polymorphism (SNP). EMSA with PRE mutants and promoter/reporter clone transfection analysis further implicated PuF in cells and extracts. Functional assays of mutant/reporter clone transfections were evaluated by ELISA of reporter protein levels. EMSA and ELISA results correlated by meta-analysis. CONCLUSIONS: We propose that PuF may regulate the APP gene promoter and that AD risk may be increased by interference with PuF regulation at the PRE. PuF is targeted by calcium/calmodulin-dependent protein kinase II inhibitor 1, which also interacts with the integrins. These proteins are connected to vital cellular and neurological functions. In addition, the transcription factor PuF is a known inhibitor of metastasis and regulates cell growth during development. Given that APP is a known cell adhesion protein and ferroxidase, this suggests biochemical links among cell signaling, the cell cycle, iron metabolism in cancer, and AD in the context of overall aging.