Phrodo cuscinimidylエステルを使用したマクロファージによるアポトーシス細胞の貪食巻き込みの測定

その複雑な分子メカニズムと、発達、ホメオスタシス、および免疫耐性における重要な調節機能により、アポトーシス細胞の食作用にかなりの関心が高まっています。アポトーシス細胞のクリアランス障害は、免疫介在性障害につながります。マクロファージによるアポトーシス細胞の飲み込みの電流定量化方法は、いくつかの制限によって潜在的に欠陥がある可能性があります。接着性マクロファージ集団は、懸濁液中のアポトーシス標的と覆われ、その後、明確な期間共培養されます。これにより、2つの異なる特徴が生じます。食作用を評価する前に表面に縛られたアポトーシス細胞を取り除くための厳密な洗浄は、食作用の喪失につながり、それによって全体的な食作用反応の見かけの大きさを歪めます。アポトーシス細胞の内在化を明確に決定するための単純で信頼できる方法が必要です。このユニットでは、pH感受性蛍光色素であるphrodo-succinimidylエステル（SE）の使用を実証して、食作用を監視するためにアポトーシス細胞を標識します。飲み込み後、マクロファージ内のpH変化により、phrodo光放射の強度が上昇します。Phrodo光放射のシフトは、フローサイトメーターまたは蛍光顕微鏡を使用して検出できます。

Considerable interest has emerged towards phagocytosis of apoptotic cells, due to its intricate molecular mechanisms and important regulatory functions in development, homoeostasis, and immune tolerance. Impaired clearance of apoptotic cells leads to immune-mediated disorders. Current quantification methods of the engulfment of apoptotic cells by macrophages are potentially flawed by several limitations. Adherent macrophage populations are overlaid with apoptotic targets in suspension and then co-cultured for a definite period, which may give rise to two different features: (1) engulfed and (2) non-engulfed macrophages that are surface-bound cell populations. Rigorous washing to dislodge surface-bound apoptotic cells before assessment of phagocytosis may lead to loss of phagocytes, thereby skewing the apparent magnitude of the overall phagocytic response. There is a need for simple and reliable methods to clearly determine the internalization of apoptotic cells. In this unit, we demonstrate the use of pHrodo-succinimidyl ester (SE), a pH-sensitive fluorescent dye, to label the apoptotic cells for monitoring the phagocytosis. After engulfment, the intensity of pHrodo light emission will be elevated due to the pH change inside of macrophages. The shift of pHrodo light emission can be detected by a flow cytometer or using a fluorescence microscope.