高速で効率的で背景のない並列クローニングのためにタンパク質発現ベクターをカスタマイズする新しい方法

背景：正しく折り畳まれたタンパク質の発現と精製は、通常、タンパク質バリアント、溶解度増強タグ、または発現ホストなどのさまざまなパラメーターのスクリーニングを必要とします。すべてのバリエーションをカバーする並列ベクトルシリーズは利用可能ですが、妥協がないわけではありません。選択したベクトルに適用できる、高速で効率的で完全に背景のないクローニングアプローチを確立しました。 結果：ここでは、並列シーケンスとライゲーション独立したクローニングのために選択された式ベクトルを調整する方法について説明します。SLICクローニングは、正確でシーケンス独立したエンジニアリングを可能にし、相同組換えによって両方のDNA端に15〜25 bpのホモロジーを含むベクトルと挿入に基づいています。E.coli、昆虫細胞、およびHEK293E細胞の並列PCRベースのクローニングとスクリーニングのために、PET、PFASTBAC、およびPTTバックボーンに基づいた発現ベクターを修正しました。挿入ベクターの逆数のために強力な構成プロモーターの制御下で有毒なCCDB遺伝子を導入しました。ベクターのバックグラウンドを減らすために一般的に使用されるDPNI治療とは対照的に、ベクターシリーズで使用されるCCDBは、細胞を運ぶ親ベクターを殺すのに100％効率的であり、ベクターの背景をゼロに減らします。さらに、CCDBの3 '端は、すべてのベクトルに共通するプライマー結合部位として機能します。2番目の共有プライマー結合部位は、タグ除去のための精製と溶解度増強タグの下流に位置するHRV 3Cプロテアーゼ切断部位によって提供されます。これまでに30を超える異なる並列発現ベクトルを生成し、このベクトルシリーズで250を超える遺伝子を正常にクローン化および発現させました。遺伝子挿入のサイズ制限はありません。クローン効率は95％> 95％で、クローン数は最大200です。手順はシンプルで、高速で、効率的で、費用対効果が高くなります。すべての発現ベクターは、EGFPの効率的な発現と、コア施設サービスで生成および精製することを要求された異なる標的タンパク質を示しました。 結論：この新しい式ベクターシリーズにより、さまざまなタンパク質コンストラクト、タグ、および発現ホストの効率的かつ費用対効果の高い並列クローニング、したがってスクリーニングが可能になります。

BACKGROUND: Expression and purification of correctly folded proteins typically require screening of different parameters such as protein variants, solubility enhancing tags or expression hosts. Parallel vector series that cover all variations are available, but not without compromise. We have established a fast, efficient and absolutely background free cloning approach that can be applied to any selected vector. RESULTS: Here we describe a method to tailor selected expression vectors for parallel Sequence and Ligation Independent Cloning. SLIC cloning enables precise and sequence independent engineering and is based on joining vector and insert with 15-25 bp homologies on both DNA ends by homologous recombination. We modified expression vectors based on pET, pFastBac and pTT backbones for parallel PCR-based cloning and screening in E.coli, insect cells and HEK293E cells, respectively. We introduced the toxic ccdB gene under control of a strong constitutive promoter for counterselection of insert less vector. In contrast to DpnI treatment commonly used to reduce vector background, ccdB used in our vector series is 100% efficient in killing parental vector carrying cells and reduces vector background to zero. In addition, the 3' end of ccdB functions as a primer binding site common to all vectors. The second shared primer binding site is provided by a HRV 3C protease cleavage site located downstream of purification and solubility enhancing tags for tag removal. We have so far generated more than 30 different parallel expression vectors, and successfully cloned and expressed more than 250 genes with this vector series. There is no size restriction for gene insertion, clone efficiency is > 95% with clone numbers up to 200. The procedure is simple, fast, efficient and cost-effective. All expression vectors showed efficient expression of eGFP and different target proteins requested to be produced and purified at our Core Facility services. CONCLUSION: This new expression vector series allows efficient and cost-effective parallel cloning and thus screening of different protein constructs, tags and expression hosts.