TNPO3は、宿主細胞の細胞質におけるCPSF6を介したカプシド安定化からHIV-1複製を保護します

背景：集中的な調査にもかかわらず、HIV-1が宿主細胞核に到達するメカニズムは不明です。SRタンパク質の核侵入を媒介するカリオフェリンであるTNPO3は、HIV-1感染に必要であることが示されました。一部の研究者は、カリファヘリンに予想されるように、TNPO3がHIV-1核輸入を促進すると報告しています。しかし、同数の調査員は、このモデルをサポートする証拠を取得できませんでした。ここでは、TNPO3がHIV-1感染性を促進するメカニズムをより明確にするために、一連の実験が行われました。 結果：HIV-1複製におけるTNPO3の役割を調べるために、HIV-1核侵入のマーカーとして一般的に使用される2-LTRサークル​​は、TNPO3ノックダウン細胞の感染後にクローン化されました。TNPO3の効果に関する文献の矛盾の潜在的な説明は、これらのクローンを何百もシーケンスすることによって提供されました。LTRの近くの部位への自己統合から生じるかなりの割合が生じたため、2-LTR円が真正ではありませんでした。この発見に応じて、2-LTRサークル​​を自己統合剤と区別するQPCR反応、およびHIV-1 cDNAの大規模な並列配列決定を含むHIV-1 cDNAを監視するための新しい手法が開発されました。これらのアッセイにより、TNPO3ノックダウンは2-LTR円のレベルを低下させることがわかりました。しかし、この発見は、以前の研究では、TNPO3依存性のHIV-1測定因子が細胞質にメガダルトンタンパク質格子を形成するHIV-1タンパク質であるCapsid（CA）であることが示されているため、不可解でした。TNPO3は、SRドメインを介して細胞スプライシング因子をインポートします。したがって、C末端SRドメインが削除された場合、HIV-1 Caに結合し、HIV-1核の輸入を阻害するSRタンパク質であるCPSF6に注意が向けられました。TNPO3ノックダウンに対する感度に対する27のHIV-1カプシド変異体の効果は、CPSF6のC末端欠失変異体による阻害に対する感度と強く相関することがわかった（R2 = 0.883、P <0.0001）。TNPO3ノックダウンは、CPSF6に細胞質に蓄積することが示されました。CPSF6へのCPSF6の誤局在化は、TNPO3ノックダウン、CPSF6核局在信号の欠失、または核輸出信号へのCPSF6の融合によるものであろうと、HIV-1複製の阻害をもたらしました。さらに、異種核局在化信号への融合により核を核に標的とすることは、TNPO3ノックダウンの阻害効果からHIV-1を救出しました。最後に、CPSF6の細胞質への誤局在は、HIV-1 Caコアの異常な安定化と関連していました。 結論：TNPO3は、Ca結合タンパク質CPSF6を核にシフトすることにより、HIV-1感染性を間接的に促進し、したがって、CPSF6の細胞質蓄積に起因する過剰なHIV-1 Ca安定性を防ぎます。

BACKGROUND: Despite intensive investigation the mechanism by which HIV-1 reaches the host cell nucleus is unknown. TNPO3, a karyopherin mediating nuclear entry of SR-proteins, was shown to be required for HIV-1 infectivity. Some investigators have reported that TNPO3 promotes HIV-1 nuclear import, as would be expected for a karyopherin. Yet, an equal number of investigators have failed to obtain evidence that supports this model. Here, a series of experiments were performed to better elucidate the mechanism by which TNPO3 promotes HIV-1 infectivity. RESULTS: To examine the role of TNPO3 in HIV-1 replication, the 2-LTR circles that are commonly used as a marker for HIV-1 nuclear entry were cloned after infection of TNPO3 knockdown cells. Potential explanation for the discrepancy in the literature concerning the effect of TNPO3 was provided by sequencing hundreds of these clones: a significant fraction resulted from autointegration into sites near the LTRs and therefore were not bona fide 2-LTR circles. In response to this finding, new techniques were developed to monitor HIV-1 cDNA, including qPCR reactions that distinguish 2-LTR circles from autointegrants, as well as massive parallel sequencing of HIV-1 cDNA. With these assays, TNPO3 knockdown was found to reduce the levels of 2-LTR circles. This finding was puzzling, though, since previous work has shown that the HIV-1 determinant for TNPO3-dependence is capsid (CA), an HIV-1 protein that forms a mega-dalton protein lattice in the cytoplasm. TNPO3 imports cellular splicing factors via their SR-domain. Attention was therefore directed towards CPSF6, an SR-protein that binds HIV-1 CA and inhibits HIV-1 nuclear import when the C-terminal SR-domain is deleted. The effect of 27 HIV-1 capsid mutants on sensitivity to TNPO3 knockdown was then found to correlate strongly with sensitivity to inhibition by a C-terminal deletion mutant of CPSF6 (R2 = 0.883, p < 0.0001). TNPO3 knockdown was then shown to cause CPSF6 to accumulate in the cytoplasm. Mislocalization of CPSF6 to the cytoplasm, whether by TNPO3 knockdown, deletion of the CPSF6 nuclear localization signal, or by fusion of CPSF6 to a nuclear export signal, resulted in inhibition of HIV-1 replication. Additionally, targeting CPSF6 to the nucleus by fusion to a heterologous nuclear localization signal rescued HIV-1 from the inhibitory effects of TNPO3 knockdown. Finally, mislocalization of CPSF6 to the cytoplasm was associated with abnormal stabilization of the HIV-1 CA core. CONCLUSION: TNPO3 promotes HIV-1 infectivity indirectly, by shifting the CA-binding protein CPSF6 to the nucleus, thus preventing the excessive HIV-1 CA stability that would otherwise result from cytoplasmic accumulation of CPSF6.