HEK293細胞の内因性TRPM4チャネルの生化学的、シングルチャネル、全細胞パッチクランプ、および薬理学的分析

ヒト胚性腎細胞293（HEK293）は、トランスフェクトされたイオンチャネルを研究するための細胞の異種発現システムとして広く使用されています。この研究は、HEK293細胞におけるTRPM4チャネルの内因性発現を特徴付けます。TRPM4は、多くの細胞タイプで発現する細胞内Ca（2+） - 活性化された非選択的カチオンチャネルです。ウエスタンブロット分析により、TRPM4の内因性発現が明らかになりました。線形電流電圧関係を備えた単一チャネル22PSコンダクタンスは、細胞内Ca（2+）の存在下でのインサイドアウトパッチクランプ構成を使用して観察されました。チャネルは、単独の陽イオンNa（+）およびK（+）に透過性がありましたが、Ca（2+）には透過性でした。開いた確率は電圧依存性であり、正のポテンシャルでは高くなりました。全細胞パッチクランプ「破裂パッチ」構成を使用して、細胞内Ca（2+） - 活性化された巨視的電流の振幅は、パッチ破裂後の時間に依存していました。初期の一時的な活性化とそれに続く、プラトー相に到達する安定した増加が観察されました。巨視的電流の生物物理学的分析は、現在の時間経過とCA（2+）感度を除き、ヒトTRPM4Bを安定してトランスフェクトしたHEK293細胞の共通特性と共通の特性を示しました。内因性の巨視的電流は高速に到達し、トランスフェクトされた電流で84.2±1.5μmに対して半軸に活性化されるには、61.9±3.5μmCa（2+）が必要でした。しかし、薬理学的特性は両方の条件で類似していた。100μmのフルフェナム酸と9-フェナントロールは、内因性電流を強く阻害しました。全体として、データはHEK293細胞における内因性TRMP4チャネルの発現を示しています。この細胞株を使用してTRPM4または他のタイプのCa（2+） - 活性化されたチャネルを研究する場合、この観察結果を考慮する必要があります。

Human embryonic kidney cells 293 (HEK293) are widely used as cellular heterologous expression systems to study transfected ion channels. This work characterizes the endogenous expression of TRPM4 channels in HEK293 cells. TRPM4 is an intracellular Ca(2+)-activated non-selective cationic channel expressed in many cell types. Western blot analyses have revealed the endogenous expression of TRPM4. Single channel 22pS conductance with a linear current-voltage relationship was observed using the inside-out patch clamp configuration in the presence of intracellular Ca(2+). The channels were permeable to the monovalent cations Na(+) and K(+), but not to Ca(2+). The open probability was voltage-dependent, being higher at positive potentials. Using the whole-cell patch clamp "ruptured patch" configuration, the amplitude of the intracellular Ca(2+)-activated macroscopic current was dependent on time after patch rupture. Initial transient activation followed by a steady-increase reaching a plateau phase was observed. Biophysical analyses of the macroscopic current showed common properties with those from HEK293 cells stably transfected with human TRPM4b, with the exception of current time course and Ca(2+) sensitivity. The endogenous macroscopic current reached the plateau faster and required 61.9±3.5μM Ca(2+) to be half-maximally activated versus 84.2±1.5μM for the transfected current. The pharmacological properties, however, were similar in both conditions. One hundred μM of flufenamic acid and 9-phenanthrol strongly inhibited the endogenous current. Altogether, the data demonstrate the expression of endogenous TRMP4 channels in HEK293 cells. This observation should be taken into account when using this cell line to study TRPM4 or other types of Ca(2+)-activated channels.