翻訳後修飾を特定するための新しいペプチドベースのSILAC法は、ER関連の分解経路における型破りなユビキチン化の証拠を提供します

小胞体関連の分解（ERAD）経路は、ユビキチン化と分解を誘導することにより、小胞体から誤って折り畳まれたタンパク質を処理する原因です。ユビキチン化は、リジン残基で従来で観察されており、システイン残基とタンパク質N末端で実証されています。ユビキチン化は、ERADプロセスの基本です。しかし、リジン残基を欠く変異T細胞受容体α（TCRα）は、ERAD経路による分解を標的としています。リジンのないTCRαのユビキチン化は、内部、非リジン残基で発生し、同じE3リガーゼがユビキチンをリジン残基の存在下または非存在下でTCRαに結合させることを示しました。質量分析は、WT-TCRαが複数のリジン残基でユビキチン化されていることを示しています。最近の出版物は、セリンとスレオニンの残基がユビキチンによって変更される可能性があるという間接的な証拠を提供しています。細胞培養（SILAC）アプローチにおける新規ペプチドベースの安定同位体標識を使用して、特定のリジンのないTCRαペプチドが修飾されることを示します。この研究では、リジンレスTCRαとの正確なリンケージはとらえどころのないままであるが、エステルベースのユビキチン化イベントの両方を検出できることを実証します。これらの発見は、SILACが修正されたペプチドを識別するためのツールとして使用できることを示しています。これは、従来のプロテオーム作業フローまたは情報学アルゴリズムを使用して検出されない新しい修正を持つものでもあります。

The endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) pathway is responsible for disposing misfolded proteins from the endoplasmic reticulum by inducing their ubiquitination and degradation. Ubiquitination is conventionally observed on lysine residues and has been demonstrated on cysteine residues and protein N-termini. Ubiquitination is fundamental to the ERAD process; however, a mutant T-cell receptor α (TCRα) lacking lysine residues is targeted for the degradation by the ERAD pathway. We have shown that ubiquitination of lysine-less TCRα occurs on internal, non-lysine residues and that the same E3 ligase conjugates ubiquitin to TCRα in the presence or absence of lysine residues. Mass-spectrometry indicates that WT-TCRα is ubiquitinated on multiple lysine residues. Recent publications have provided indirect evidence that serine and threonine residues may be modified by ubiquitin. Using a novel peptide-based stable isotope labeling in cell culture (SILAC) approach, we show that specific lysine-less TCRα peptides become modified. In this study, we demonstrate that it is possible to detect both ester and thioester based ubiquitination events, although the exact linkage on lysine-less TCRα remains elusive. These findings demonstrate that SILAC can be used as a tool to identify modified peptides, even those with novel modifications that may not be detected using conventional proteomic work flows or informatics algorithms.