[臨床分離株に由来する逆転写酵素領域を運ぶB型肝炎ウイルスDNAを複製する安定した細胞株の確立]

目的：臨床分離株に由来する逆転写酵素配列を運ぶB型肝炎ウイルス（HBV）DNAを複製できる安定した細胞株を確立する。 方法：ネストされたPCRを使用して、血清からHBV DNAフラグメントを増幅しました。フラグメントは、フラグメント置換反応（FSR）によってin vitroでのHBV複製をサポートできるプラスミドにクローニングされ、その後、HBV DNAから下流のフラグメントを発現するネオマイシンのクローニングが続きました。G418選択は、組換えDNAによるHEPG2細胞のトランスフェクション後に実施されました。リアルタイムPCRおよび酵素リンクされた免疫吸着アッセイ（ELISA）を使用して、HBV DNAを複製できる安定した細胞株をスクリーニングし、サザンブロット分析を使用して細胞株によるHBV DNAの複製を確認しました。 結果：血清DNAから増幅されたフラグメントNT55-1654をプラスミドPLLに置き、プラスミドP11を生成しました。ネオマイシンフラグメントをP11にクローニングし、プラスミドP11-NEOにつながり、P11-NEOがHBV複製能力であることが確認されました。HBV DNAを複製できる3-10という名前の安定した細胞株が得られました。 結論：臨床分離株に由来する逆転写酵素配列を運ぶHBV DNAを複製できる安定した細胞株が確立されました。リアルタイムPCRプラスELISAは、HBV DNAを複製する安定した細胞株を迅速にスクリーニングするのに役立つ場合があります。

OBJECTIVE: To establish a stable cell line that can replicate hepatitis B virus (HBV) DNA carrying the reverse transcriptase sequence derived from a clinical isolate. METHODS: Nested PCR was used to amplify the HBV DNA fragment from the serum. The fragment was cloned into a plasmid that can support HBV replication in vitro by fragment substitution reaction (FSR), followed by the cloning of the neomycin expressing fragment downstream from HBV DNA. G418 selection was conducted after the transfection of HepG2 cells with the recombinant DNA. Real-time PCR and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) were used to screen stable cell lines that can replicate HBV DNA, and the replication of HBV DNA by the cell line was confirmed by using Southern blot analysis. RESULTS: Fragment nt55-1654 amplified from the serum DNA was substituted to the plasmid pLL, generating the plasmid p11. The neomycin fragment was cloned into p11, leading to the plasmid p11-neo, and p11-neo was confirmed to be HBV-replication-competent. A stable cell line named 3-10 that can replicate HBV DNA was obtained. CONCLUSIONS: A stable cell line was established that can replicate HBV DNA carrying the reverse transcriptase sequence derived from a clinical isolate. Real-time PCR plus ELISA may help to rapidly screen out stable cell lines replicating HBV DNA.