ヒスチジンが豊富なタンパク質とペプチドの特性評価のための磁気ナノ粒子ベースのプラットフォーム

この研究では、親和性プローブとしてFe3O4@al2O3磁気ナノ粒子（MNP）を使用して、複雑なサンプルからポリヒスチジン（HIS）タグ付きタンパク質/ペプチドを迅速に濃縮するために使用できるプラットフォームを開発しました。pH 7では、Poly-HIの間の解離定数、すなわちHis6、およびFe3O4@al2O3 MNPSは〜10（-5）mで、トラッピング容量はHis6で〜100 nmol/mgでした。濃縮は、マトリックス支援レーザー脱着/イオン化（MALDI）プレートに直接ピペットすることにより、サンプル溶液（<2μL）とMNP（1-3μg）を10秒間直接ピペットすることにより、濃縮を達成しました。したがって、分析に必要な濃縮とサンプル量の時間は大幅に減少します。濃縮後、MNPターゲット種のコンジュゲートは、サンプルの端に磁石を配置して、コンジュゲートを〜5秒以内に小さなスポットに凝集させて、非標的種を簡単に除去できるようにすることにより、迅速に分離されました。さらに、MALDI質量分析（MS）分析中にターゲット種に「スイートスポット」を見つける問題は、マルディプレート上の標的種を磁気的に分離することにより大幅に減少しました。したがって、His6の検出の限界は、〜400 Amolほど低かった。His6とahhahhaad ahhahhaadは、それぞれタンパク質ダイジェストとヒト血漿をスパイクし、複雑なサンプルからのHisリッチペプチドの選択的濃縮においてこのアプローチの実用性を実践することを実証するためにサンプルとして使用されました。また、Fe3O4@al2O3 MNPSによってオンプレートを濃縮したHis6タグ付きタンパク質を特徴づけ、その後、プレート上のトリプティック消化、選択的濃縮、およびMALDI-MS分析を特徴づけました。このアプローチを使用して、His6タグ付き種がサンプルに存在するかどうかを迅速に判断できます。さらに、His6にタグ付けされた組換え志節様毒素を含む細胞溶解物をサンプルとして使用して、非常に複雑なサンプルの分析におけるこのアプローチの実現可能性をさらに実証しました。オンプレート濃縮と酵素消化とそれに続くMALDI-MS分析を含む分析プロセス全体を10分以内に完了できます。

In this study, we developed a platform that can be used to rapidly enrich polyhistidine(His)-tagged proteins/peptides from complex samples selectively using the Fe3O4@Al2O3 magnetic nanoparticles (MNPs) as the affinity probes. At pH 7, the dissociation constant between poly-His, i.e., His6, and the Fe3O4@Al2O3 MNPs was ~10(-5) M and the trapping capacity was ~100 nmol/mg for His6. Enrichment was achieved by vigorously mixing the sample solution (<2 μL) and the MNPs (1-3 μg) by pipetting directly onto a matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) plate for 10 s. The time for the enrichment and the sample volume required for analysis are therefore greatly reduced. After enrichment, the MNP-target species conjugates were promptly isolated by positioning a magnet on the edge of the sample well to aggregate the conjugates into a small spot within ~5 s so that the nontarget species could be easily removed. Additionally, the problem of finding "sweet spots" on the target species during the MALDI mass spectrometry (MS) analysis was greatly reduced by magnetically isolating the target species on the MALDI plate. The limit of detection for His6 was, therefore, as low as ~400 amol. His6 and AHHAHHAAD AHHAHHAAD spiked in a protein digest and in human plasma, respectively, were used as the samples to demonstrate the practicability of this approach in selective enrichment of His-rich peptides from complex samples. We also characterized His6-tagged proteins enriched on-plate by the Fe3O4@Al2O3 MNPs followed by on-plate tryptic digestion, selective enrichment, and MALDI-MS analysis. This approach can be used to determine quickly whether His6-tagged species are present in a sample. In addition, cell lysates containing recombinant Shiga-like toxins tagged with His6 were used as the samples to further demonstrate that the feasibility of this approach in analyzing very complex samples. The entire analysis process, including the on-plate enrichment and enzymatic digestion followed by MALDI-MS analysis, can be completed within 10 min.