病原体を含む液胞の分離

Dictyostelium discoideum細胞は、多種多様な細菌、酵母、および不活性粒子を摂取するため、「専門的な食細胞」です。いくつかの細菌性病原体は、宿主シグナル伝達経路を妨害することにより、D。disoideumの特殊な液胞内で細胞内で生存することができます。これらの進化的保存プロセスの根底にある分子メカニズムをよりよく理解するために、病原体を含む液胞（PCV）の分離方法を確立しました。分離プロトコルは、細胞内病原体レジオネラ肺炎球菌によるD.椎間板細胞の感染、リソソームコンパートメントのコロイド鉄の負荷、宿主細胞の機械的溶解、ヨードフェニルニトロフェニルテトラゾリウム（INT）核型菌の除去、核酸による除去、ヨードフェニルニトロフェニルテトラゾリウム（INT）の重い標識、遠心分離、およびリソソームの磁気除去。不連続なスクロース密度オプション勾配の細胞内分画により、ミトコンドリアの分離が可能になり、PCVを高い純度で調製できます。PCVから分離されたタンパク質は、質量分析に成功し、液胞の病原体指向の成熟プロセスを分析することができました。この方法は、その後のタンパク質修飾分析とリピドームの比較にも適用できます。

Dictyostelium discoideum cells are "professional phagocytes," as they ingest a large variety of bacteria, yeast, and inert particles. Several bacterial pathogens are able to survive intracellularly within specialized vacuoles of D. discoideum by interfering with host signaling pathways. To better understand the molecular mechanisms underlying these evolutionary conserved processes we have established a method for the isolation of pathogen-containing vacuoles (PCVs). The isolation protocol describes the infection of D. discoideum cells with the intracellular pathogen Legionella pneumophila, loading of the lysosomal compartment with colloidal iron, mechanical lysis of host cells, iodophenylnitrophenyltetrazolium (INT) heavy labeling of mitochondria, removal of nucleic acid by Benzonase treatment, separation of nuclei by low-speed centrifugation, and the magnetic removal of lysosomes. The subcellular fractionation in a discontinuous sucrose density OptiPrep gradient allows the separation of mitochondria and to prepare PCVs with high purity. The proteins isolated from PCVs have been successfully subjected to mass spectrometry and allowed to analyze pathogen-directed maturation processes of vacuoles. The method can also be applied for subsequent protein modification analyses and lipidome comparisons.