血清、血漿、脳脊髄液のネイティブクロマトグラフィーサンプル調製は、タンパク質分解バイオマーカー損失のリスクを含むものではありません

最近、プロテオームバイオマーカー検索のための血清および血漿分別のためのネイティブ多次元クロマトグラフィー法を開発しました。この方法には、並列化と自動化、高い再現性とプロテオームカバレッジ、分子量とサンプル量に関する柔軟なダイナミックレンジ、質量分析、保持代謝産物、錯体形成、修正、および成分の断片化に関する情報、オプションの酵素および免疫学的分析など、いくつかの利点があります。それにもかかわらず、ネイティブの状態は、内因性プロテイナーゼによるプロテオームの変化とバイオマーカー損失のリスクがあります。したがって、ここでは、血清、血漿、脳脊髄液からのネイティブサンプルおよび画分、ならびにサンプルハンドリングおよび分別条件下での調製中の固有の抗タンパク質の有効性の内因性タンパク質分解活性を定量化しようとしました。したがって、（1）内因性タンパク質およびペプチド画分の総割合、（2）アゾカゼイン加水分解、（3）質量分析タンパク質被覆とペプチド数。1へ：すべての非分配標本で、タンパク質濃度または分子量の減少も、さまざまな凝固または前インキュベーション時間後にペプチド濃度の増加も見られませんでした。2：室温で数時間以内に調製した場合、これらのサンプルではアゾカゼイン加水分解は見られませんでした。トリプシンは、0.85μg/ml（0.04μm）を超えない濃度で添加すると、完全に阻害されました。さらに、ネイティブ1-D画分では、プロテイナーゼ活性は観察できませんでした。3：質量分析により、タンパク質被覆率もペプチドの数も、さまざまなインキュベーション時間後の1-Dまたは2D画分で有意に違いはないことを確認しました。これらの結果は、本質的な天然のプロテイナーゼ阻害剤が考慮されるプロテオームを潜在的に保護し、血清、血漿、脳脊髄液を伴うネイティブ条件下で「トップダウン」プロテオームアプローチを可能にすることを示唆しています。

We recently developed a native multidimensional chromatographic method for serum and plasma fractionation for proteomic biomarker search. This method has several advantages:parallelization and automation, high reproducibility and proteome coverage, flexible dynamic range with respect to molecular weight and sample amount, optional enzymatic and immunological analytics additional to mass spectrometry, retaining metabolites, and information on complex formation, modification, and fragmentation of constituents. Nevertheless, native conditions have the probable risk of proteome alteration and biomarker loss by intrinsic proteinases. Hence, we tried to quantify here intrinsic proteolytic activity in native samples and fractions from serum, plasma and cerebrospinal fluid, as well as the effectiveness of intrinsic anti-proteinases during sample handling and preparation under our fractionation conditions. Therefore, we used several quantitative measures: (1) total proportion of intrinsic protein and peptide fractions, (2) azocasein hydrolysis and (3) mass spectrometric protein coverage and peptide numbers. To 1: In all non-fractionated specimens, neither decrease of protein concentration or molecular weight nor increase of peptide concentration was found after variable clotting or pre-incubation time. To 2: No azocasein hydrolysis was seen in these samples when prepared within a few hours at room temperature. Trypsin, when added in concentrations not higher than 0.85 μg/mL (0.04 μM), even was completely inhibited. Moreover, in native 1-D fractions no proteinase activity could be observed. To 3: Mass spectrometry confirmed that neither protein coverage nor peptide numbers differ significantly in 1-D or 2-D fractions after variable incubation time. These results suggest that intrinsic, native proteinase inhibitors potentially protect the proteomes considered, enabling “top-down” proteomic approaches under native conditions with serum, plasma and cerebrospinal fluid.