ELISAによるHordeinsの定量化：正しい標準は違いの大きさを作ります

背景：Coeliacsには、グルテンを含まない食品におけるグルテン（Hordein）の正確な測定に支えられた生涯にわたるグルテンを含まない食事が必要です。2011年には60億ドルを超える価値があるグルテンフリーの食品産業は、現在、アッセイされているサンプルを代表していない可能性のある基準に対して較正された2つのELISAプロトコルに依存しています。 目的：ビール中のホルデインのELISA分析の精度に影響する要因を調べました。 結果：シンプルなアルコール - ジチオトレイトール抽出プロトコルは、大麦の小麦粉と麦芽からホルデインの大部分を正常に抽出します。主要なホーダイン標準は、FPLCによって精製されました。ELISAは、さまざまなクラスの精製ホルデインを非常に異なる感度で検出しました。異なるホルデインとの特定のELISA反応の解離定数（kd）は、3桁によって変化しました。異なる抗体を使用してELISAによって決定された同じホルダインのKDは、最大2桁変化しました。ElisaキットまたはHordein Standardのいずれかの選択は、結果に偏り、解釈を混乱させる可能性があります。 結論：ホーダインの正確な決定には、ELISA反応を較正するために使用されるホーダイン標準が、試験物質に存在するホルデインと組成が同一であることが必要です。実際には、各テスト食品から代表的なホーダイン標準を分離することは実現できません。ELISAは、異なるホルデインの間で異なり、絶対ホルデイン濃度に関連していない可能性のある特定のアミノ酸エピトープの濃度のみを列挙するため、質量分析はELISAよりも信頼性が高いことをお勧めします。MSの定量化は、個々のホルダインアイソフォームの定量化を可能にする特異的でユニークなペプチドを使用して行われます。

BACKGROUND: Coeliacs require a life-long gluten-free diet supported by accurate measurement of gluten (hordein) in gluten-free food. The gluten-free food industry, with a value in excess of $6 billion in 2011, currently depends on two ELISA protocols calibrated against standards that may not be representative of the sample being assayed. AIM: The factors affecting the accuracy of ELISA analysis of hordeins in beer were examined. RESULTS: A simple alcohol-dithiothreitol extraction protocol successfully extracts the majority of hordeins from barley flour and malt. Primary hordein standards were purified by FPLC. ELISA detected different classes of purified hordeins with vastly different sensitivity. The dissociation constant (Kd) for a given ELISA reaction with different hordeins varied by three orders of magnitude. The Kd of the same hordein determined by ELISA using different antibodies varied by up to two orders of magnitude. The choice of either ELISA kit or hordein standard may bias the results and confound interpretation. CONCLUSIONS: Accurate determination of hordein requires that the hordein standard used to calibrate the ELISA reaction be identical in composition to the hordeins present in the test substance. In practice it is not feasible to isolate a representative hordein standard from each test food. We suggest that mass spectrometry is more reliable than ELISA, as ELISA enumerates only the concentration of particular amino-acid epitopes which may vary between different hordeins and may not be related to the absolute hordein concentration. MS quantification is undertaken using peptides that are specific and unique enabling the quantification of individual hordein isoforms.