急性虚血性脳卒中後のラット脳組織におけるザイモグラフィーを通じて、MMP-2およびMMP-9の切り捨てられたまたは成熟した形態の発現を区別する際の複雑さ

マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）は、虚血脳卒中の病因に重要な役割を果たします。特に、MMP 2と9の成熟した型は同様のサイズを持ち、ゼラチンを共通の基質として共有しています。両方のMMPは虚血性脳卒中で上方制御され、脳卒中の病因中に有害な役割を果たします。この研究を通して、これらの酵素間の顕著なサイズの違い（それぞれ72対95 kDa）のために、虚血ラット脳組織ホモジネートのプロMMP-2およびPro-MMP-9が免疫ブロッティングまたはザイモグラフィによって検出されることを実証しました。ただし、成熟したMMP-2とMMP-9は、これらのフォームのほぼ同一サイズ（それぞれ66 kDaと67 kDa）のため、ザイモグラフィで識別することはできません。虚血ラットの脳脳組織ホモジネートでのゼラチンザイモグラフィーの使用により、成熟MMP-2および/またはMMP-9の不均一なバンドに対応する65 kDa MMPバンドが明らかになりました。さらに、組換えヒトMMP-2とMMP-9の両方から生成された65 kDaの成熟MMPも検出されました。ゼラチン - アガロースビーズを使用したラット脳組織ホモジネートのプルダウンアッセイを使用して、MMP-2とMMP-9のPROと成熟型の両方の活性の増加を示しました。ただし、不均一なバンドからのそれぞれの成熟したMMPの起源を決定することはできませんでした。したがって、この研究では、成熟したMMP-2とMMP-9の同定と定量化がZymographyのみを使用して達成できないことを実証しました。したがって、MMP-2およびMMP-9を標的とする新しい脳卒中療法をテストするには、それぞれのMMPを特定して測定するための信頼できる手法の開発が必要です。

Matrix metalloproteinases (MMPs) play an important role in the pathogenesis of ischaemic stroke. In particular, the mature forms of MMPs 2 and 9 have similar sizes and share gelatine as a common substrate. Both MMPs are upregulated in ischaemic stroke and play detrimental roles during stroke pathogenesis. Throughout this study, we demonstrated that pro-MMP-2 and pro-MMP-9 from ischaemic rat brain tissue homogenate is detected either through immunoblotting or zymography because of the remarkable size difference between these enzymes (72 versus 95 kDa, respectively). However, the mature MMP-2 and MMP-9 cannot be discriminated through zymography because of the almost identical sizes of these forms (66 and 67 kDa, respectively). The use of gelatine zymography on ischaemic rat brain tissue homogenate revealed a 65-kDa MMP band, corresponding to the heterogeneous band of mature MMP-2 and/or MMP-9. Furthermore, we also detected mature MMPs of 65 kDa generated from both recombinant human MMP-2 and MMP-9. Using a pull down assay in rat brain tissue homogenate with gelatine-agarose beads, we showed increased activities for both the pro and mature forms of MMP-2 and MMP-9. However, we could not determine the origin of the respective mature MMPs from the heterogeneous band. Thus, in this study, we demonstrated that the identification and quantification of mature MMP-2 and MMP-9 could not be achieved using zymography alone. Therefore, the development of a reliable technique to identify and measure the respective MMPs is needed to test new stroke therapies targeting MMP-2 and MMP-9.