システイン置換GABAA受容体で測定されたアロステリックアゴニスト部位の状態依存性エトミデート占有

リガンド受容体理論の中心公理は、アゴニストが不活性受容体よりも活性により密接に結合するということです。ただし、不活性受容体のアゴニスト親和性の測定は、付随する活性化によって混乱します。ユニークな特性を持つシステイン置換変異体γ-アミノ酪酸A（GABAA）受容体を特定し、不活性受容体と活性受容体の両方でアロステリックアゴニスト部位の占有を決定できるようにしました。アロステリックアゴニストであるエトミデートは、M3ドメインのβ2M286残基近くの膜貫通部位を介してα1β2γ2LGABAA受容体を活性化または調節する麻酔薬です。α1β2M286cγ2L受容体の電圧クランプ電気生理学研究は、GABAが有効なアゴニストであり、エトミデートがGABA活性化活性を調節することを示していますが、直接的なエトミデートアゴニズムは存在しません。確立されたMonod-Wyman-Changeux（MWC）アロステリックモデルを使用した変異活性の定量分析は、活性対不活性受容体に対する相対的な親和性として定義されるエトミデートの固有の有効性が野生型受容体よりも低いことを示しています。パラクロロメルコリベンゼンスルホン酸は、β2M286C側鎖スルフヒドリルを共有結合し、GABA誘導電流を不可逆的に変化させます。エトミデート濃度は、電気生理学的に追跡されたβ2M286C-PCMBS結合形成の見かけの速度を依存して減少させます。高いエトミデート濃度は、共有結合の修飾からβ2M286Csuflhydrylを完全に保護し、密接な立体相互作用を示唆しています。50％の保護エトミデート濃度（PC50）は、不活性受容体で14μM、GABA活性化中は1.1〜2.2μMであり、活性化受容体が不活性受容体よりも熱心にエトミデートを結合することを実験的に実証します。実験的なPC50値は、不活性受容体と活性受容体の両方におけるエトミデート解離定数のMWCモデル予測に非常に近いため、検証します。私たちの結果は、リガンド依存性イオンチャネルのアゴニズム、協調性、および変調を理解するための有効なフレームワークとしてMWCモデルをサポートしています。

A central axiom of ligand-receptor theory is that agonists bind more tightly to active than to inactive receptors. However, measuring agonist affinity in inactive receptors is confounded by concomitant activation. We identified a cysteine substituted mutant γ-aminobutyric acid type A (GABAA) receptor with unique characteristics allowing the determination of allosteric agonist site occupancy in both inactive and active receptors. Etomidate, the allosteric agonist, is an anesthetic that activates or modulates α1β2γ2L GABAA receptors via transmembrane sites near β2M286 residues in M3 domains. Voltage-clamp electrophysiology studies of α1β2M286Cγ2L receptors show that GABA is an efficacious agonist and that etomidate modulates GABA-activated activity, but direct etomidate agonism is absent. Quantitative analysis of mutant activity using an established Monod-Wyman-Changeux (MWC) allosteric model indicates that the intrinsic efficacy of etomidate, defined as its relative affinity for active versus inactive receptors, is lower than in wild-type receptors. Para-chloromercuribenzene sulfonate covalently modifies β2M286C side-chain sulfhydryls, irreversibly altering GABA-induced currents. Etomidate concentration dependently reduces the apparent rate of β2M286C-pCMBS bond formation, tracked electrophysiologically. High etomidate concentrations completely protect the β2M286C suflhydryl from covalent modification, suggesting close steric interactions. The 50% protective etomidate concentration (PC50) is 14 μM in inactive receptors and 1.1 to 2.2 μM during GABA-activation, experimentally demonstrating that activated receptors bind etomidate more avidly than do inactive receptors. The experimental PC50 values are remarkably close to, and therefore validate, MWC model predictions for etomidate dissociation constants in both inactive and active receptors. Our results support MWC models as valid frameworks for understanding the agonism, coagonism, and modulation of ligand-gated ion channels.