ネイティブタンパク質結紮によって生成されたカルモジュリンのフェルスター共鳴エネルギー伝達研究は、ドメイン間の静電反発を明らかにします

この研究では、溶液中のカルモジュリンの立体構造に対する長距離タンパク質の静電相互作用の影響を探ります。アンサンブルフェルスター共鳴エネルギー伝達（FRET）は、残留物17のドナーと位置117のアクセプターと特異的に組み込まれたフルオロフォアペアを含むカルモジュリンについて測定されます。このコンストラクトは、固相ペプチド合成、クローン、発現、ネイティブの化学的ライゲーションの組み合わせによって生成されました。この標識方法は、以前はカルモジュリンで使用されておらず、フルオロフォアの明示的な位置を確保するための便利な方法を表しています。アンサンブルFRET実験は、カルシウムを含まないタンパク質の球状ドメイン間の有意な静電反発を明らかにしています。低塩では、カルモジュリンは比較的拡張されており、ドメイン間の距離は、変性、熱、または非イオン性の変性剤によってさらに増加し​​ます。ドメイン間の反発は塩によってスクリーニングされ、カルシウム結合によっても減少します。これにより、タンパク質ネット電荷が-23から-15に変化します。低塩のカルシウムを含まない形態と比較して、カルシウム結合形態のフレット効率は平均して10倍増加しました。カルシウム型の立体構造は、塩スクリーニングに鈍感です。これらの結果は、カルモジュリンの2つの球状ドメインが標的と相互作用する場合、静電相互作用のために有意な自由エネルギーペナルティがないことを意味します。

This study explores the influence of long-range intra-protein electrostatic interactions on the conformation of calmodulin in solution. Ensemble Förster resonance energy transfer (FRET) is measured for calmodulin with a fluorophore pair incorporated specifically with a donor at residue 17 and an acceptor at position 117. This construct was generated by a combination of solid phase peptide synthesis, cloning, expression and native chemical ligation. This labelling method has not previously been used with calmodulin and represents a convenient method for ensuring the explicit positioning of the fluorophores. The ensemble FRET experiments reveal significant electrostatic repulsion between the globular domains in the calcium-free protein. At low salt, calmodulin has a relatively extended conformation and the distance between the domains is further increased by denaturation, by heat or by non-ionic denaturants. The repulsion between domains is screened by salt and is also diminished by calcium binding, which changes the protein net charge from -23 to -15. Compared with the calcium-free form at low salt, the FRET efficiency for the calcium-bound form has, on average, increased 10-fold. The conformation of the calcium form is insensitive to salt screening. These results imply that when the two globular domains of calmodulin interact with target, there is no significant free energy penalty due to electrostatic interactions.