ボツリヌスニューロトキシンタイプAの検出感度を高めるためのマイクロスケールニューロンおよびシュワン細胞共培養モデル

ボツリヌス神経毒（BONT）は強力で特異的な生体分子であり、両方ともバイオテロリズムの潜在的な脅威として関与し、治療に使用されます。Bontの発生または制御された分布を管理するために、Bontアクティビティを測定する非常に敏感で堅牢なアッセイが必要です。現在のin vivoおよびin vitroアッセイには、マウスバイオアッセイの高コストと変動性、一次および幹細胞由来ニューロンの広範な製剤、細胞株の固有の低感度など、制限があります。細胞株の感度は、直接的な分化とその生理学的関連性（無細胞戦略と比較）および堅牢性（一次細胞戦略と比較）によって増加することができます。細胞株を採用することは、in vivoアッセイの魅力的な代替品です。ここでは、直接区別せずにBont血清型A（Bont/A）に対して細胞株の感度を改善する2つの異なる戦略を提示します。マイクロスケール培養とニューロンおよびシュワン細胞株の共培養、NG108-15およびS16を使用して、感度と生理学的関連の両方を改善する細胞ベースのBontアッセイを開発しました。結果は、NG108-15およびS16共培養がMacroscaleでEC50を12.5から0.8ng/µL（P <0.001）に減少させ、マイクロスケールで2.6から1.1Ng/µL（P = 0.006）に減少させたことを示しました。さらに、マイクロスケールのNG108-15モノカルチャーは、マクロスケールと比較してEC50を12.5から2.6Ng/µL（P <0.001）に減少させました。最後に、マイクロスケール共培養の空間的配置を制御すると、S16由来の可溶性因子が感度を高めることができることが明らかになりました。したがって、我々の研究は、共培養とマイクロスケール培養を使用して、Bontに対する細胞株の感度を高めるための2つの異なる戦略を実証し、それによりBont検出のためにアッセイ技術を進めます。

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and specific biomolecule that is both implicated as a potential threat in bioterrorism and used in therapeutics. Highly sensitive and robust assays that measure BoNT activity are needed to manage outbreak or controlled distribution of BoNT. Current in vivo and in vitro assays have limitations, including high costs and variability for mouse bioassays, extensive preparations for primary and stem cell-derived neurons, and inherent low sensitivity for cell lines. Sensitivity of cell lines can be increased by direct differentiation and with their physiological relevance (compared with cell-free strategies) and robustness (compared with primary cell strategies); adopting cell lines is an attractive alternative to in vivo assays. Here, we present two distinct strategies that improved sensitivity of a cell line to BoNT serotype A (BoNT/A) without direct differentiation. We developed a cell-based BoNT assay using microscale culture and coculture of neuronal and Schwann cell lines, NG108-15 and S16, respectively, to improve both sensitivity and physiological relevance. Results showed that NG108-15 and S16 coculture decreased EC50 from 12.5 to 0.8ng/µl (p < 0.001) in macroscale and from 2.6 to 1.1ng/µl (p = 0.006) in microscale. In addition, NG108-15 monoculture at microscale decreased EC50 from 12.5 to 2.6ng/µl (p < 0.001) compared with macroscale. Finally, controlling the spatial arrangement of microscale coculture revealed that S16-derived soluble factors can increase sensitivity. Thus, our study demonstrates two distinct strategies for increasing the sensitivity of a cell line to BoNT using coculture and microscale culture, thereby advancing assay technology for BoNT detection.