新規ヒト子宮内膜細胞株を使用した胚性幹細胞の導出と維持のためのゼノフリーの非接触共培養システムの開発

目的：マウス胚線維芽細胞フィンガー層（MEF）は、胚性幹細胞（ESC）の多能性を培養し、維持するために従来使用されてきました。この研究では、新しいヒト子宮内膜細胞株を使用して、ESCの伝播と派生のための非Xeno非接触共培養システムを開発する可能性を探ります。このようなXenoのないシステムは、治療用途に適した臨床グレードのヒトESCラインの確立に不可欠であることが証明される場合があります。 方法：ヒト子宮内膜細胞の新規ラインを6ウェル皿に播種しました。マウスESCを含むフィルターインサートをこれらのウェルに配置し、週に2〜3回継続しました。マウス胚盤胞に由来する内部細胞腫瘤は、フィーダー層の存在下でトランスウェルでも培養されました。どちらの場合も、SSEA-1、Sox-2、Oct-4、およびアルカリホスファターゼの染色を使用して、幹細胞の保持を監視しました。 結果：ESCコロニーは、培養で120日以上、これまでの44の通路で幹細胞の形態と属性を保持しました。内側の細胞腫瘤由来ESC培養は、すべての幹細胞特性を保持した6つの通路を通じて、45日間多能状態で維持されました。幹細胞コロニーは、幹細胞特異的マーカーSSEA-1、SOX 2、OCT-4およびアルカリホスファターゼを発現しました。ヒトフィーダー層を除去すると、コロニー内の細胞形態に明確な変化があり、ESC分化の証拠がありました。 結論：ヒトフィーダー層は、MEFフィーダーセルまたはESC培養のためにMEF条件付けられた培地の使用から簡単なパスを提供します。さらに、多孔質膜を使用して2つの細胞タイプを分離する間接共培養により、継代中に幹細胞製剤による幹細胞調製の汚染を防ぐことができます。

PURPOSE: Mouse embryonic fibroblast feeder layers (MEF) have conventionally been used to culture and maintain the pluripotency of embryonic stem cells (ESC). This study explores the potential of using a novel human endometrial cell line to develop a non-xeno, non-contact co-culture system for ESC propagation and derivation. Such xeno-free systems may prove essential for the establishment of clinical grade human ESC lines suitable for therapeutic application. METHODS: A novel line of human endometrial cells were seeded in a 6-well dish. Filter inserts containing mouse ESCs were placed on these wells and passaged 2-3 times per week. Inner cell masses derived from mouse blastocysts were also cultured on transwells in the presence of the feeder layer. In both cases, staining for SSEA-1, SOX-2, OCT-4 and alkaline phosphatase were used to monitor the retention of stem cells. RESULTS: ESC colonies retained their stem cell morphology and attributes for over 120 days in culture and 44 passages to date. Inner cell mass derived ESC cultures were maintained in a pluripotent state for 45 days, through 6 passages with retention of all stem cell characteristics. The stem cell colonies expressed stem cell specific markers SSEA-1, Sox 2, Oct-4 and alkaline phosphatase. Upon removal of the human feeder layer, there was a distinct change in cell morphology within the colonies and evidence of ESC differentiation. CONCLUSIONS: Human feeder layers offer a simple path away from the use of MEF feeder cells or MEF conditioned medium for ESC culture. Furthermore, indirect co-culture using porous membranes to separate the two cell types can prevent contamination of stem cell preparations with feeder cells during passaging.