（GGGGS）nリンカーを含む操作されたタンパク質におけるO-キシロシル化の発見と調査

タンパク質エンジニアリングは、有効性の向上、安全性の向上、免疫原性の低下、およびより良い送達のために、治療タンパク質を設計または修正するための強力なツールです。GGGGS [（g4s）n]リンカーは、プロテアーゼに対する柔軟性と耐性のため、タンパク質を工学するときに一般的に使用されます。ただし、翻訳後修飾（PTM）は、これらのリンカーのSER残基で発生する可能性があります。ここでは、（G4S）N> 2リンカーのセリン残基でのO-キシロシル化の発生を初めて報告します。O-キシロシル化は、分子量測定、ペプチドマッピング分析、およびMS/MSシーケンスの結果として発見されました。私たちの調査では、（I）O-キシロシル化は（G4S）（n> 2）リンカーの一般的なPTMであることが示されました。（ii）GSGはO-キシロシル化のモチーフです。（iii）リンカーあたりのキシロシル化の総量は、リンカー内のGSGモチーフ数が増加するにつれて増加します。また、私たちの調査では、O-キシロシル化レベルはある程度クローン依存性であることが示されていますが、キシロシル化レベルは、2％<2％から25％> 25％> 25％> 25％> 25％> 25％> 25％であるタンパク質の間で大きく異なります。キシロシルトランスフェラーゼによる部位。私たちの研究は、薬物が均一で高品質であることを確認するために、（G4S）Nリンカーを含む潜在的な治療タンパク質をO-キシロシル化について綿密に監視する必要があることを示しています。o-キシロシル化の除去と還元の戦略も調べられ、議論されました。

Protein engineering is a powerful tool for designing or modifying therapeutic proteins for enhanced efficacy, greater safety, reduced immunogenicity, and better delivery. GGGGS [(G4S)n] linkers are commonly used when engineering a protein, because of their flexibility and resistance to proteases. However, post-translational modifications (PTMs) can occur at the Ser residue in these linkers. Here, we report, for the first time, the occurrence of O-xylosylation at the serine residue in (G4S)n>2 linkers. The O-xylosylation was discovered as a result of molecular mass determination, peptide mapping analysis, and MS/MS sequencing. Our investigation showed that (i) O-xylosylation is a common PTM for (G4S)(n>2) linkers; (ii) GSG is the motif for O-xylosylation; and (iii) the total amount of xylosylation per linker increases as the number of GSG motifs in the linker increases. Our investigation has also shown that the O-xylosylation level is clone-dependent, to a certain degree, but the xylosylation level varies considerably among the proteins examined-from <2% to >25% per linker-likely depending on the accessibility to the sites by the xylosyltransferase. Our work demonstrates that potential therapeutic proteins containing (G4S)n linkers should be closely monitored for O-xylosylation in order to ensure that drugs are homogeneous and of high quality. The strategies for elimination and reduction of O-xylosylation were also examined and are discussed.