ワンステップの超促進または超遠心分離のいずれかによって濃縮されたレンチウイルスベクター製剤の特性評価と比較性能

レンチウイルスベクター（LVS）を利用した遺伝子治療は、多くの遺伝性単一疾患の実際の治療的代替品を構成します。したがって、高速で非難的で費用対効果の高い戦略を使用した機能的ベクトルの生成が不可欠です。VSV-G偽型のレンチウイルスの利用可能な濃度方法の中で、高い治療力を達成するために、超遠心分離は最も一般的なアプローチを表しています。ただし、この手順では特別な取り扱いと特別な計装へのアクセスが必要です。これは時間がかかり、最も重要なことは、超遠心装置の高いメンテナンス費用と消耗品のために費用対効果が高いことです。ここでは、標準的な細胞培養媒体を使用した過渡的なトランスフェクションによってベクターストックが調製され、超微細ろ過によって濃縮される改善されたプロトコルについて説明します。精製ステップの関与なし。ウイルスを濃縮するための限外ろ過それ自体は新しい手順ではありませんが、私たちの作品は1つの大きな斬新さを示しています。ペプチドの質量指紋分析を使用して、超微細ろ過によって生成されるウイルスバッチの性質と成分を特徴づけました。また、フローサイトメトリーを使用することによりウイルス機能力価を決定し、ブラウン運動に基づいたレーザーベースのナノ粒子追跡分析を使用して、実際のウイルス粒子サイズと濃度をリアルタイムで評価しました。この産生法によって生成されるベクターは無傷のビリオンに含まれており、テストすると、マウスの総骨髄またはヒトCD34（+）造血幹細胞のいずれかをin vitroで伝達するために、標準的な超拡散を使用して産生されるレンチウイルスベクターと比較して、等しい変換効率と毒性の低下をもたらしました。- ベースのメソッド。この研究からのデータは、最終的に、遺伝子治療の臨床試験のプロトコルの改善と技術的修正につながる可能性があります。

Gene therapy utilizing lentiviral vectors (LVs) constitutes a real therapeutic alternative for many inherited monogenic diseases. Therefore, the generation of functional vectors using fast, non-laborious and cost-effective strategies is imperative. Among the available concentration methods for VSV-G pseudotyped lentiviruses to achieve high therapeutic titers, ultracentrifugation represents the most common approach. However, the procedure requires special handling and access to special instrumentation, it is time-consuming, and most importantly, it is cost-ineffective due to the high maintenance expenses and consumables of the ultracentrifuge apparatus. Here we describe an improved protocol in which vector stocks are prepared by transient transfection using standard cell culture media and are then concentrated by ultrafiltration, resulting in functional vector titers of up to 6×10(9) transducing units per millilitre (TU/ml) without the involvement of any purification step. Although ultrafiltration per se for concentrating viruses is not a new procedure, our work displays one major novelty; we characterized the nature and the constituents of the viral batches produced by ultrafiltration using peptide mass fingerprint analysis. We also determined the viral functional titer by employing flow cytometry and evaluated the actual viral particle size and concentration in real time by using laser-based nanoparticle tracking analysis based on Brownian motion. Vectors generated by this production method are contained in intact virions and when tested to transduce in vitro either murine total bone marrow or human CD34(+) hematopoietic stem cells, resulted in equal transduction efficiency and reduced toxicity, compared to lentiviral vectors produced using standard ultracentrifugation-based methods. The data from this study can eventually lead to the improvement of protocols and technical modifications for the clinical trials for gene therapy.