人間の遺伝子治療のためのスケーラブルで安全なAAVベクター生成のための非相同組換えを排除するという概念

遺伝子治療のための高品質の組換えアデノ関連ウイルス（RAAV）のスケーラブルで効率的な生産の生成は、最近の臨床的成功にもかかわらず課題のままです。AAVヘルパー遺伝子のキャリアとして細胞質ワクシニアウイルスを使用することにより可能になった2つの異なる細胞内コンパートメントでAAVヘルパー遺伝子とRAAVベクターDNAを隔離することにより、スケーラブルで効率的なRAAV産生のための新しい戦略を開発しました。初めて、レプリケーションに適したAAV粒子（RCAAV）の汚染は、ユビキタスな非相同性再結合を回避することにより、理論的に完全に排除できます。ベクターDNAは、宿主ゲノムに統合したり、アデノウイルスなどの核ターゲティングベクターによって送達されたりできます。懸濁HeLa細胞では、細胞ごとに達成されたベクター収率は、従来のトリプルプラスミドトランスフェクション法からのベクトル収率と類似しています。RCAAV汚染は、私たちのアッセイの限界で検出できませんでした。さらに、この新しい概念は、RAAVの生産だけでなく、他のDNAベクターの生産にも使用できます。

Scalable and efficient production of high-quality recombinant adeno-associated virus (rAAV) for gene therapy remains a challenge despite recent clinical successes. We developed a new strategy for scalable and efficient rAAV production by sequestering the AAV helper genes and the rAAV vector DNA in two different subcellular compartments, made possible by using cytoplasmic vaccinia virus as a carrier for the AAV helper genes. For the first time, the contamination of replication-competent AAV particles (rcAAV) can be completely eliminated in theory by avoiding ubiquitous nonhomologous recombination. Vector DNA can be integrated into the host genomes or delivered by a nuclear targeting vector such as adenovirus. In suspension HeLa cells, the achieved vector yield per cell is similar to that from traditional triple-plasmid transfection method. The rcAAV contamination was undetectable at the limit of our assay. Furthermore, this new concept can be used not only for production of rAAV, but also for other DNA vectors.