多重化されたリアルタイム核酸配列ベース増幅（NASBA）のエンジニアリング洞察：ポイントオブケア診断の設計への影響

背景：核酸配列ベースの増幅（NASBA）は、低コストのポイントオブケア（POC）診断デバイスの大きな可能性を提供しますが、高い偽陽性率とプライマー設計の課題によって制限されています。 目的：NASBAデザインの体系的な分析を提供して、適用性を拡大することを目的としています。 方法：ダイマー形成に影響を与えるパラメーターを調べ、偽陽性の結果を減らし、より多くのPOC診断アプリケーションにNASBAを適切にするNASBAプライマーを設計するためのフレームワークを提供します。次に、3つの異なるオリゴヌクレオチドセットを比較して、（1）ダイマー形成の阻害効果、（2）設計が不十分なプライマーによる誤検知、および（3）リアルタイムNASBA中のビーコンターゲット位置の効果を調べます。必要なT7プロモーター配列は、反応速度論に悪影響を及ぼしますが、共通の要約配列は精度を犠牲にすることなく速度論を改善できます。 結果：設計が不十分なプライマーは、ターゲットRNAの非存在下でリアルタイムの指数増幅を受けることを実証し、真の陽性の場合は45分に対して50分間のピーク値（t（1/2））の半分から50分の時間までの誤検知をもたらします。抑制性二量体を避けるためにオリゴヌクレオチドを再設計すると、誤検知が排除され、真の陽性T（1/2）が10分減少しました。最後に、2つの分子ビーコン設計スキームの有効性を確認し、2つの臨床シナリオでそれらの多重化ユーティリティを議論します。 結論：この研究は、POC診断アッセイの開発にNASBAを使用するための経路を提供します。

BACKGROUND: Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) offers huge potential for low-cost, point-of-care (POC) diagnostic devices, but has been limited by high false-positive rates and the challenges of primer design. OBJECTIVE: We offer a systematic analysis of NASBA design with a view toward expanding its applicability. METHODS: We examine the parameters that effect dimer formations, and we provide a framework for designing NASBA primers that will reduce false-positive results and make NASBA suitable for more POC diagnostic applications. Then we compare three different oligonucleotide sets to examine (1) the inhibitory effect of dimer formations, (2) false positives with poorly designed primers, and (3) the effect of beacon target location during real-time NASBA. The required T7 promoter sequence adversely affects the reaction kinetics, although the common abridged sequence can improve kinetics without sacrificing accuracy. RESULTS: We demonstrate that poorly designed primers undergo real-time exponential amplification in the absence of target RNA, resulting in false positives with a time to half of the peak value (t(1/2)) of 50 min compared to 45 min for true positives. Redesigning the oligonucleotides to avoid inhibitory dimers eliminated false positives and reduced the true positive t(1/2) by 10 min. Finally, we confirm the efficacy of two molecular beacon design schemes and discuss their multiplexing utility in two clinical scenarios. CONCLUSION: This study provides a pathway for using NASBA in developing POC diagnostic assays.