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発達に関与する重要なエピジェネティックな修飾である5-メチルシトシン（5-MC）は、5-ヒドロキシメチルシトシン（5-HMC）に酵素的に変換できます。5-HMCは、活性DNAシトシン脱メチル化の中間体と見なされ、それ自体がエピジェネティックマークとして機能します。ほとんどの哺乳類細胞の5-HMC含有量は低く、液体クロマトグラフィマス分析（LC-MS）による5-HMCの定量化は、未修飾ヌクレオシドの存在によるイオン抑制に頻繁に苦しんでいます。この問題を回避するために、T4β-グルコシルトランスファーゼを使用して、グルコシル基を5-HMCのヒドロキシメチル部分に選択的に移し、より親水性残基（β-グルコシル-5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジン、5-GMDC）を形成する方法を開発しました。液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）分析の前に、水生相互作用を介してNH2シリカを使用して、より親水性の5-GMDCを選択的に濃縮することができます。これにより、イオン抑制が排除され、検出感度と精度が大幅に向上します。この方法を使用して、3つのヒト細胞株と7つの酵母株のゲノムDNAの5-HMC含有量を正常に定量化しました。私たちの知る限り、これは酵母のモデル生物における5-HMCの存在に関する最初の報告です。さらに、Schizosaccharomyces Pombeの2つの酵母株における5-HMCの含有量は5-MCの含有量よりもさらに高く、5-HMCが酵母の生理機能に重要な役割を果たす可能性があることを示しています。
発達に関与する重要なエピジェネティックな修飾である5-メチルシトシン（5-MC）は、5-ヒドロキシメチルシトシン（5-HMC）に酵素的に変換できます。5-HMCは、活性DNAシトシン脱メチル化の中間体と見なされ、それ自体がエピジェネティックマークとして機能します。ほとんどの哺乳類細胞の5-HMC含有量は低く、液体クロマトグラフィマス分析（LC-MS）による5-HMCの定量化は、未修飾ヌクレオシドの存在によるイオン抑制に頻繁に苦しんでいます。この問題を回避するために、T4β-グルコシルトランスファーゼを使用して、グルコシル基を5-HMCのヒドロキシメチル部分に選択的に移し、より親水性残基（β-グルコシル-5-ヒドロキシメチル-2'-デオキシシチジン、5-GMDC）を形成する方法を開発しました。液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）分析の前に、水生相互作用を介してNH2シリカを使用して、より親水性の5-GMDCを選択的に濃縮することができます。これにより、イオン抑制が排除され、検出感度と精度が大幅に向上します。この方法を使用して、3つのヒト細胞株と7つの酵母株のゲノムDNAの5-HMC含有量を正常に定量化しました。私たちの知る限り、これは酵母のモデル生物における5-HMCの存在に関する最初の報告です。さらに、Schizosaccharomyces Pombeの2つの酵母株における5-HMCの含有量は5-MCの含有量よりもさらに高く、5-HMCが酵母の生理機能に重要な役割を果たす可能性があることを示しています。
5-Methylcytosine (5-mC), an important epigenetic modification involved in development, can be converted enzymatically to 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC). 5-hmC is considered an intermediate of active DNA cytosine demethylation and makes itself serve as an epigenetic mark. 5-hmC content in most mammalian cells is low and the quantification of 5-hmC by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) frequently suffers from ion suppression by the presence of unmodified nucleosides. To circumvent this problem, we developed a method to selectively transfer a glucosyl group to the hydroxymethyl moiety of 5-hmC and form a more hydrophilic residue (β-glucosyl-5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine, 5-gmdC) by using T4 β-glucosyltransferase. The more hydrophilic 5-gmdC can be selectively enriched by using NH2-silica via hydrophilic interaction prior to liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis, which eliminates the ion suppression and significantly improves the detection sensitivity and accuracy. Using this method, we successfully quantified 5-hmC content in genomic DNA of three human cell lines and seven yeast strains. To the best of our knowledge, this is the first report about the existence of 5-hmC in the model organism of yeast. In addition, the contents of 5-hmC in two yeast strains of Schizosaccharomyces pombe are even higher than those of 5-mC, indicating that 5-hmC may play important roles on the physiological functions of yeast.
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