非還元SDS-PAGEにおけるモノクローナル抗体断片化アーチファクトの調査

モノクローナル抗体の断片化は、主に遊離スルフヒドリル基によって触媒されたジスルフィド結合スクランブルにより、非還元SDS-PAGEで日常的に観察されており、その結果、手法が誘導されたアーチファクトがあります。このアーティファクトを最小限に抑えるために、ヨードアセトアミド（IAM）やn-エチルマレイミド（NEM）などのアルキル化剤が一般にSDSサンプルバッファーに含まれて、遊離スルフヒドリルをブロックしました。ただし、エージェントの選択と適用濃度は、研究ごとに異なります。さらに、これまでこれらのエージェントの直接的な比較はなく、適切なエージェントの選択が困難になります。これらの質問に対処するために、IgG4モノクローナル抗体のフラグメントバンドアーティファクトを阻害するIAMとNEMの活性をテストしました。私たちのデータは、両方の薬剤の阻害活性が濃度に依存していることを示唆しています。興味深いことに、5mm Nemは40 mm IAMと同じ阻害効果を達成できます。さらに、NEMは延長されたサンプル加熱の後も強い活動を保持していましたが、IAMはその活動のほとんどを失いました。全体として、NEMは、SDS-PAGEまたはCE-SDSメソッドのいずれかで、すべてのテストされたIgG4タンパク質よりもIAMよりも優れた阻害効果があるようです。これらの観察結果は、NEMがIAMよりも強い断片化阻害活性を持っていることを示しているため、この断片化アーティファクトを減らすために、SDS-PAGEおよびCE-SDS法の両方に適したアルキル化剤であることが示されています。

Fragmentation of monoclonal antibodies has been routinely observed in non-reducing SDS-PAGE, mainly due to disulfide-bond scrambling catalyzed by free sulfhydryl groups, resulting in a method induced artifact. To minimize this artifact, alkylating agents like iodoacetamide (IAM) and N-ethylmaleimide (NEM) were commonly included in SDS sample buffer to block free sulfhydryls. However, the selection of agents and the applied concentrations differ from study to study. In addition, there is no direct comparison of these agents thus far, resulting in difficulties in selecting the suitable agent. To address these questions, we have tested the activities of IAM and NEM in inhibiting the fragment-band artifact of IgG4 monoclonal antibodies. Our data suggest that the inhibition activity of both agents is concentration dependent. Interestingly, 5mM NEM can achieve the same inhibition effect as 40 mM IAM. In addition, NEM still retained strong activity after prolonged sample heating, whereas IAM lost most of its activity. Overall, NEM appears to have a better inhibition effect than IAM on all tested IgG4 proteins, either with SDS-PAGE or CE-SDS methods. These observations demonstrate that NEM has stronger fragmentation inhibition activity than IAM, and thus is a more suitable alkylating agent for both SDS-PAGE and CE-SDS method to reduce this fragmentation artifact.