ラット腎近位複合尿細管の代謝性アシドーシスへの反応のプロテオミクスプロファイリングと経路分析

代謝性アシドーシスは、血中pHおよび重炭酸塩濃度の減少として定義される比較的一般的な病理学的状態です。腎近位複合尿細管は、血漿グルタミンの抽出を増加させ、アンモン症と糖新生を活性化することにより、この状態に反応します。結合されたプロセスは、酸の排泄を増加させ、血液に加えて酸塩基の恒常性を部分的に回復させる重炭酸イオンを生成します。ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼなど、少数のサイトゾルタンパク質は、代謝性アシドーシスに対する腎反応に役割を果たすことを決定しました。したがって、サイトゾルプロテオームの応答をよりよく特徴付けるために、さらなる分析が行われました。アシドーシスの発症後、さまざまな時にラット腎臓皮質から近位畳み込み尿細管細胞を分離し、分別して可溶性サイトゾルタンパク質を残りの細胞成分から分離しました。サイトゾルタンパク質は、2次元の液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析（MS/MS）を使用して分析されました。スペクトルカウントと平均MS/MS総イオン電流を使用して、相対タンパク質の存在量の時間的変化を定量化しました。全体で、461個のタンパク質が自信を持って特定され、そのうち24個が存在量の統計的に有意な変化を示しました。これらの手法を検証するために、観察された存在量の変化のいくつかがウエスタンブロットによって確認されました。次に、サイトゾル画分からのデータを以前のプロテオミクスデータと組み合わせて組み合わせ、経路分析を実行して、代謝性アシドーシスの開始中に近位の複雑な尿細管で活性化または阻害される主要な経路を特定しました。

Metabolic acidosis is a relatively common pathological condition that is defined as a decrease in blood pH and bicarbonate concentration. The renal proximal convoluted tubule responds to this condition by increasing the extraction of plasma glutamine and activating ammoniagenesis and gluconeogenesis. The combined processes increase the excretion of acid and produce bicarbonate ions that are added to the blood to partially restore acid-base homeostasis. Only a few cytosolic proteins, such as phosphoenolpyruvate carboxykinase, have been determined to play a role in the renal response to metabolic acidosis. Therefore, further analysis was performed to better characterize the response of the cytosolic proteome. Proximal convoluted tubule cells were isolated from rat kidney cortex at various times after onset of acidosis and fractionated to separate the soluble cytosolic proteins from the remainder of the cellular components. The cytosolic proteins were analyzed using two-dimensional liquid chromatography and tandem mass spectrometry (MS/MS). Spectral counting along with average MS/MS total ion current were used to quantify temporal changes in relative protein abundance. In all, 461 proteins were confidently identified, of which 24 exhibited statistically significant changes in abundance. To validate these techniques, several of the observed abundance changes were confirmed by Western blotting. Data from the cytosolic fractions were then combined with previous proteomic data, and pathway analyses were performed to identify the primary pathways that are activated or inhibited in the proximal convoluted tubule during the onset of metabolic acidosis.