Lysotracker染料の使用：オートファジーのフローサイトメトリー研究

Lysotracker染料のフローサイトメトリー使用は、オートファジープロセスを調査し、これを微小管関連タンパク質Lc3bであるオートファジーマーカーのアップレギュレーションと比較するために使用されました。リソトラッカー染料の作用メカニズムは完全には理解されていませんが、顕微鏡で使用されて酸性球状オルガネラを画像化しており、フローサイトメトリーでの使用はオートファジーの研究では徹底的に調査されていません。この調査では、クロロキン（CQ）、ラパマイシン、低血清（<1％）RPMI、および栄養飢ationを含む多数のオートファジー誘導剤を使用して、ユルカットT細胞白血病およびK562エリスコムエロイド細胞株のオートファジーを誘導します。LC3BはCQ治療による増加を示しましたが、これは用量と時間の観点からLysotrackerシグナルとは異なりました。ラパマイシン、低血清（<1％）RPMI、およびオートファジーの栄養飢vation誘導も、ライソスタッカーとLC3Bシグナルの増加を引き起こしました。CQはまた、細胞株のアポトーシスを誘導し、パンカスパーゼ阻害剤Z-VADによってブロックされ、アポトーシスを受ける細胞の減少とその後のオートファジーマーカーLC3Bおよびリソソーム染料シグナルのアップレギュレーションをもたらしました。LC3BとLysotrackerがオートファジープロセスでさまざまな生物学的イベントを測定していることを考えると、それらは驚くほどオートファジープロセス中に上方制御されました。しかし、この研究では、リソトラッカー染料は細胞内のリソソームまたはオートファゴソームを特異的に標識していないが、オートファジー関連のプロセスと他のライブセル機能の同時測定を可能にすることを示しています。技術。この方法には、他のライブセルLCB-GFPタグ付き実験の利点があり、患者細胞を分析するために使用し、使いやすく、コストが大幅に低くなります。

The flow cytometric use of LysoTracker dyes was employed to investigate the autophagic process and to compare this with the upregulation of autophagy marker, the microtubule-associated protein LC3B. Although the mechanism of action of LysoTracker dyes is not fully understood, they have been used in microscopy to image acidic spherical organelles, and their use in flow cytometry has not been thoroughly investigated in the study of autophagy. This investigation uses numerous autophagy-inducing agents including chloroquine (CQ), rapamycin, low serum (<1%) RPMI, and nutrient starvation to induce autophagy in Jurkat T-cell leukemia and K562 erythromyeloid cell lines. LC3B showed an increase with CQ treatment although this was different to LysoTracker signals in terms of dose and time. Rapamycin, low serum (<1%) RPMI, and nutrient starvation induction of autophagy also induced an increase in LysoTracker and LC3B signals. CQ also induced apoptosis in cell lines, which was blocked by pan-caspase inhibitor z-VAD resulting in a reduction in cells undergoing apoptosis and a subsequent upregulation of autophagic markers LC3B and lysosomal dye signals. Given that LC3B and LysoTracker are measuring different biological events in the autophagic process, they surprisingly both upregulated during autophagic process. This study, however, shows that although LysoTracker dyes do not specifically label lysosomes or autophagosomes within the cell, they allow the simultaneous measurement of an autophagy-related process and other live-cell functions, which are not possible with the standard LC3B antibody-labeling technique. This method has the advantage of other live-cell LCB-GFP-tagged experiments in that be used to analyze patient cells as well as easier to use and significantly less costly.