疎水性が低下したライブラリの第2世代のDARPの設計、構造、および特性評価

設計されたアンキリンリピートタンパク質（DARPIN）は、非常に安定した非抗体足場に基づいた確立された結合分子です。ダーピンターゲット複合体の13の結晶構造とダルピン変異体の安定性測定に基づいて、拡張されたランダム化表面を含む新しいダルピンライブラリを生成しました。膜タンパク質などの疎水性表面を含む困難なターゲットに対する選択中に、非特異的疎水性バインダーの濃縮に対抗するために、多様な位置でのアポーラ残基の頻度は、チロシンの数の増加によって大幅に減少し、置換されました。2つのヒトカスパーゼと膜輸送体のACRBに対するリボソームディスプレイの選択により、主にモノマーであるユニークで強力なダルピンバインダーの非常に濃縮されたプールが得られました。バインダーの選択中のトリプトファン残基の顕著な濃縮に注目しました。カスパーゼ-7を含む複雑なこのライブラリの代表の結晶構造は、標的接触を提供する際にトリプトファンとチロシンの両方の重要な役割を視覚化します。したがって、これらの芳香族および極性鎖は、元のダルピンのアポーラ残基バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびフェニルアラニンを代用します。私たちの研究では、既存のバインダー足場を拡張するために必要な生物物理学的および構造的分析について説明し、非常に多様な合成バインダーライブラリのアセンブリの既存のプロトコルを簡素化します。

Designed ankyrin repeat proteins (DARPins) are well-established binding molecules based on a highly stable nonantibody scaffold. Building on 13 crystal structures of DARPin-target complexes and stability measurements of DARPin mutants, we have generated a new DARPin library containing an extended randomized surface. To counteract the enrichment of unspecific hydrophobic binders during selections against difficult targets containing hydrophobic surfaces such as membrane proteins, the frequency of apolar residues at diversified positions was drastically reduced and substituted by an increased number of tyrosines. Ribosome display selections against two human caspases and membrane transporter AcrB yielded highly enriched pools of unique and strong DARPin binders which were mainly monomeric. We noted a prominent enrichment of tryptophan residues during binder selections. A crystal structure of a representative of this library in complex with caspase-7 visualizes the key roles of both tryptophans and tyrosines in providing target contacts. These aromatic and polar side chains thus substitute the apolar residues valine, leucine, isoleucine, methionine, and phenylalanine of the original DARPins. Our work describes biophysical and structural analyses required to extend existing binder scaffolds and simplifies an existing protocol for the assembly of highly diverse synthetic binder libraries.