細胞質アクチン：精製および単一分子アッセイアッセイ

アクチン細胞骨格は、すべての真核細胞に不可欠です。重要な構造的役割を果たすことに加えて、フィラメントへのアクチンのアセンブリは、細胞の運動性、細胞質分裂、エンドサイトーシスを含む多様な細胞プロセスを促進します。アクチン重合は、アクチンの空間的および時間的アセンブリ、およびこれらのフィラメントの物理的特性を制御する多数の補因子によって厳しく調節されています。精製成分からのアクチン重合のin vitroモデルの開発により、アクチン細胞骨格に対するこれらのタンパク質の効果を決定する上で大きな進歩が可能になりました。ここでは、ピレンアクチンアセンブリアッセイを使用して、核形成やキャッピング因子などのタンパク質によって直接または媒介されるアクチンアセンブリの動態に対するタンパク質の効果を決定する方法について説明します。第二に、タンパク質がアクチンフィラメント構造を調節する方法についての洞察を与えるために、in vitroで作成されたフィラメントを視覚化するために蛍光標識されたファロイジンを使用する方法を示します。最後に、総内部反射蛍光（TIRF）顕微鏡を使用して、単一のアクチンフィラメントと蛍光標識アクチン結合タンパク質の動的なアセンブリと分解を視覚化する方法について説明します。

The actin cytoskeleton is essential to all eukaryotic cells. In addition to playing important structural roles, assembly of actin into filaments powers diverse cellular processes, including cell motility, cytokinesis, and endocytosis. Actin polymerization is tightly regulated by its numerous cofactors, which control spatial and temporal assembly of actin as well as the physical properties of these filaments. Development of an in vitro model of actin polymerization from purified components has allowed for great advances in determining the effects of these proteins on the actin cytoskeleton. Here we describe how to use the pyrene actin assembly assay to determine the effect of a protein on the kinetics of actin assembly, either directly or as mediated by proteins such as nucleation or capping factors. Secondly, we show how fluorescently labeled phalloidin can be used to visualize the filaments that are created in vitro to give insight into how proteins regulate actin filament structure. Finally, we describe a method for visualizing dynamic assembly and disassembly of single actin filaments and fluorescently labeled actin binding proteins using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.