ハイスループットシーケンスによるトランスポゾン挿入のクローン拡大分析は、ピギーバック変異誘発スクリーニングで候補癌遺伝子を識別します

マウスにおける体性トランスポゾン変異誘発は、腫瘍形成の遺伝的メカニズムを調査するための効率的な戦略です。腫瘍駆動トランスポゾン挿入の特定は、伝統的に、一般的な挿入部位に関する情報を取得するために、大きな腫瘍コホートの生成を必要とします。腫瘍駆動挿入は、トランスポゾン変異誘発のゆっくりと進化する変換プロセスによって促進される現象である腫瘍組織におけるクローンの拡大によっても特徴付けられます。ここでは、個々の腫瘍で得られた配列読み取りの相対的な割合を定量化することにより、挿入のクローン膨張を評価する腫瘍駆動挿入の検出のための改善されたアプローチを説明します。この目的のために、腫瘍DNAとイルミナシーケンスの音響せん断を利用する挿入部位シーケンスのプロトコルを開発しました。ピギーバック変異誘発によって生成されたさまざまな固形腫瘍を分析し、各腫瘍について> 10> 10°の挿入部位に対応する読み取り値が得られました。各腫瘍では、尾DNAコントロールから得られた周波数と比較した場合、9〜25件の挿入が濃縮されたシーケンス読み取り周波数によって際立っていました。これらの濃縮された挿入は、潜在的なクローンで拡張された腫瘍駆動挿入であり、したがって候補癌遺伝子を特定します。我々の研究の候補癌遺伝子は、多くの確立された癌遺伝子で構成されていましたが、首謀者のような様子（MAMLD1）やジアシルグリセロールキナーゼ・デルタ（DGKD）などの新規候補遺伝子も含まれていました。ハイスループットシーケンスによるクローン拡大分析は、個々の腫瘍のレベルでの挿入変異誘発スクリーンにおける候補癌遺伝子の同定のための堅牢なアプローチであることを示しています。

Somatic transposon mutagenesis in mice is an efficient strategy to investigate the genetic mechanisms of tumorigenesis. The identification of tumor driving transposon insertions traditionally requires the generation of large tumor cohorts to obtain information about common insertion sites. Tumor driving insertions are also characterized by their clonal expansion in tumor tissue, a phenomenon that is facilitated by the slow and evolving transformation process of transposon mutagenesis. We describe here an improved approach for the detection of tumor driving insertions that assesses the clonal expansion of insertions by quantifying the relative proportion of sequence reads obtained in individual tumors. To this end, we have developed a protocol for insertion site sequencing that utilizes acoustic shearing of tumor DNA and Illumina sequencing. We analyzed various solid tumors generated by PiggyBac mutagenesis and for each tumor >10⁶ reads corresponding to >10⁴ insertion sites were obtained. In each tumor, 9 to 25 insertions stood out by their enriched sequence read frequencies when compared to frequencies obtained from tail DNA controls. These enriched insertions are potential clonally expanded tumor driving insertions, and thus identify candidate cancer genes. The candidate cancer genes of our study comprised many established cancer genes, but also novel candidate genes such as Mastermind-like1 (Mamld1) and Diacylglycerolkinase delta (Dgkd). We show that clonal expansion analysis by high-throughput sequencing is a robust approach for the identification of candidate cancer genes in insertional mutagenesis screens on the level of individual tumors.