ターゲットを絞ったゲノム編集を介した特性スタッキング

現代の農業には、複数の特性を搭載した作物が要求しています。独立してトランスジェンを分離してランダムに統合および並べ替えるという現在のパラダイムは、深刻な下流の繁殖の課題を生み出します。ここに汎用性の高い、一般的に適用可能なソリューションが提供されます。モジュラーの「形質着陸パッド」（TLPS）を備えた、「混合およびマッチ」、オンマンド輸送統合、および作物の植物の積み重ねを可能にするモジュラーの「特性着陸パッド」（TLP）を備えた高効率標的ゲノム編集の組み合わせ。除草剤耐性特性の積み重ねにそれを適用することにより、ヌクレアーゼ駆動型TLP技術の有用性を説明します。最初にトウモロコシのゲノムに統合された除草剤抵抗性遺伝子、PATは、胚性懸濁液培養のWhiskers™を介した変換を使用して、TLP（ZFNターゲット部位とDNAと相同のDNAと相同）が隣接しています。未熟な胚の微粒子爆撃に基づいて標的導入遺伝子統合の方法を確立し、それを使用して、2番目の除草剤耐性遺伝子を含むドナーDNAを含むドナーDNAを介して、対応するTLPと統合されたZFN発現コンストラクトとの統合TLPに隣接する配列を含むドナーDNAを使用して、TLPに2番目の特性を実現しました。驚くべきことに、胚由来のトランスジェニックイベントの最大5％は、TLP、つまりPAT導入遺伝子に直接隣接するAAD1導入遺伝子を正確に統合しました。重要なのは、ヌクレアーゼ駆動型TLP技術を介して達成された並置と一致しており、どちらも後続の世代に融合した除草剤耐性の特性がゼロであり、それによって2つの独立した形質転換されたトランスジェンの結合を示しています。ZFNを介した標的導入遺伝子の統合は、よりますます多くの作物種に適用可能になっているため、この作業は、特性積み重ねに対するシンプルで簡単で迅速なアプローチを例示しています。

Modern agriculture demands crops carrying multiple traits. The current paradigm of randomly integrating and sorting independently segregating transgenes creates severe downstream breeding challenges. A versatile, generally applicable solution is hereby provided: the combination of high-efficiency targeted genome editing driven by engineered zinc finger nucleases (ZFNs) with modular 'trait landing pads' (TLPs) that allow 'mix-and-match', on-demand transgene integration and trait stacking in crop plants. We illustrate the utility of nuclease-driven TLP technology by applying it to the stacking of herbicide resistance traits. We first integrated into the maize genome an herbicide resistance gene, pat, flanked with a TLP (ZFN target sites and sequences homologous to incoming DNA) using WHISKERS™-mediated transformation of embryogenic suspension cultures. We established a method for targeted transgene integration based on microparticle bombardment of immature embryos and used it to deliver a second trait precisely into the TLP via cotransformation with a donor DNA containing a second herbicide resistance gene, aad1, flanked by sequences homologous to the integrated TLP along with a corresponding ZFN expression construct. Remarkably, up to 5% of the embryo-derived transgenic events integrated the aad1 transgene precisely at the TLP, that is, directly adjacent to the pat transgene. Importantly and consistent with the juxtaposition achieved via nuclease-driven TLP technology, both herbicide resistance traits cosegregated in subsequent generations, thereby demonstrating linkage of the two independently transformed transgenes. Because ZFN-mediated targeted transgene integration is becoming applicable across an increasing number of crop species, this work exemplifies a simple, facile and rapid approach to trait stacking.