フラビン依存性酸化還元酵素の古い黄色の酵素の合成円形順列ライブラリからの改善されたバイオ触媒

古い黄色の酵素（OYE）ファミリーのメンバーは、活性化されたアルケンの立体選択的トランス水素化のために、広く使用されている効果的な生体触媒です。基質範囲をさらに拡大し、触媒性能を向上させるために、Saccharomyces PastorianusからのOYE1の機能を強化するために、Circular Permutation（CP）と呼ばれるタンパク質工学戦略を適用しました。CPは、OYE1の触媒サイクルがレート制限立法の変化を伴うと考えられているため、タンパク質の骨格の柔軟性とアクティブな部位のアクセシビリティを変化させることにより、両方の重要なパフォーマンス機能を変更することにより、バイオ触媒の機能に影響を与える可能性があります。OYE1タンパク質シーケンス全体でのCPの影響を調査するために、全遺伝子合成とin vitro転写/翻訳を組み合わせることにより、細胞のないCpoyeライブラリの調製に非常に効率的なアプローチを実装しました。このようなex vivo系の汎用性は、3つの参照基質ケトイソフォロン、シンナムアルデヒド、および（S） - カーボンを含む可変環境条件下でのライブラリメンバーの迅速かつ信頼性の高い機能評価によってさらに実証されました。ライブラリ分析により、70を超える機能的OYE1バリアントが特定され、いくつかのバイオ触媒が数桁改善された触媒活性を示しました。個々のcpoyeライブラリメンバーの触媒ゲインは基質によって異なりますが、すべてのテストされた物質の官能性バリアントの新しいタンパク質末端の位置は、活性部位近くの同じ4つの異なるループ/蓋領域に収まります。我々の発見は、酵素機能におけるこれらの構造要素の重要性を示し、野生型OYEの触媒の制限要因としての立体配座の柔軟性の仮説をサポートしています。

Members of the old yellow enzyme (OYE) family are widely used, effective biocatalysts for the stereoselective trans-hydrogenation of activated alkenes. To further expand their substrate scope and improve catalytic performance, we have applied a protein engineering strategy called circular permutation (CP) to enhance the function of OYE1 from Saccharomyces pastorianus. CP can influence a biocatalyst's function by altering protein backbone flexibility and active site accessibility, both critical performance features because the catalytic cycle for OYE1 is thought to involve rate-limiting conformational changes. To explore the impact of CP throughout the OYE1 protein sequence, we implemented a highly efficient approach for cell-free cpOYE library preparation by combining whole-gene synthesis with in vitro transcription/translation. The versatility of such an ex vivo system was further demonstrated by the rapid and reliable functional evaluation of library members under variable environmental conditions with three reference substrates ketoisophorone, cinnamaldehyde, and (S)-carvone. Library analysis identified over 70 functional OYE1 variants with several biocatalysts exhibiting over an order of magnitude improved catalytic activity. Although catalytic gains of individual cpOYE library members vary by substrate, the locations of new protein termini in functional variants for all tested substates fall within the same four distinct loop/lid regions near the active site. Our findings demonstrate the importance of these structural elements in enzyme function and support the hypothesis of conformational flexibility as a limiting factor for catalysis in wild type OYE.