拡張PCRクローニングの重複

組換えタンパク質に対する需要の増加は、効率的で信頼できるクローニング方法の開発を動機付けています。ここでは、初心者が制限エンドヌクレアーゼまたはT4 DNAリガーゼを使用せずに選択したプラスミドに実質的にすべてのDNA挿入をクローンする方法を示します。5 '端でプラスミド配列をコードするキメラプライマーと3'末端にシーケンスを挿入することが設計され、合成されます。眼（®）DNAポリメラーゼは、PCRによって目的の挿入物を増幅するために利用されます。二本鎖製品は、その後、円形プラスミドとのPCRのような反応で一対のメガプライマーとして採用されます。次に、元のプラスミドは、DPN Iを使用した制限消化で破壊されます。オーバーラップ拡張PCRの産物は、有能な大腸菌細胞を変換するために使用されます。フュージョン（®）DNAポリメラーゼは、増幅反応と融合反応の両方に使用されるため、両方のステップを同じ方法で監視および最適化できます。

Rising demand for recombinant proteins has motivated the development of efficient and reliable cloning methods. Here we show how a beginner can clone virtually any DNA insert into a plasmid of choice without the use of restriction endonucleases or T4 DNA ligase. Chimeric primers encoding plasmid sequence at the 5' ends and insert sequence at the 3' ends are designed and synthesized. Phusion(®) DNA polymerase is utilized to amplify the desired insert by PCR. The double-stranded product is subsequently employed as a pair of mega-primers in a PCR-like reaction with circular plasmids. The original plasmids are then destroyed in restriction digests with Dpn I. The product of the overlap extension PCR is used to transform competent Escherichia coli cells. Phusion(®) DNA polymerase is used for both the amplification and fusion reactions, so both steps can be monitored and optimized in the same way.