脂肪酸二重結合位置異性体の識別と定量：電荷スイッチ誘導体化を使用したショットガンリピドミクスアプローチ

哺乳類の脂質における二重結合の特定の位置は、生物学的膜構造、ダイナミクス、脂質の第二メッセンジャー生産に大きな影響を及ぼします。ここでは、脂肪酸二重結合位置異性体の同定と定量化のために、n-（4-アミノメチルフェニル）ピリジニウム（AMPP）とタンデム質量分析で電荷スイッチ誘導体を利用するショットガンリピドミクスアプローチについて説明します。脂肪酸の電荷スイッチ誘導体化に続いて、陽性イオンモードイオン化と断片化分析、分析感度の著しい増加（低FMOL/μL）、および二重結合位置異性体の識別を得ることができます。具体的には、AMPP誘導体化された脂肪酸における近位二重結合の位置は、近位オレフィン炭素からの著しく減少した1,4-水素除去に起因する診断フラグメントイオンによって特定されます。アリルの切断に起因する追加の断片化パターンは、二重結合位置の割り当てをさらに実証しました。さらに、脂肪酸二重結合位置異性体の定量化は、特徴的なフラグメントイオンの正規化強度の線形関係と、離散脂肪酸位置異性体の異性体組成によって達成されます。ヒト血清中の脂肪酸の分析のためにこのアプローチの適用は、リノレン酸の2つの二重結合異性体の存在を示しています（すなわちΔ（6,9,12）18：3、γ-リノレン酸（GLA）、およびδ（9,12,15）18：3、α-リノレン酸（ALA））。驚くべきことに、中性脂質でエステル化されたGLA対ALAの異性比は、エステル化されていない部分の比率よりも3倍高かった。この開発された方法を通じて、脂肪酸構造異性体の以前は過小評価されていない、または不明確な変化を決定することが、疾患中の脂質代謝の新しいバイオマーカーの同定と不適応の変化を促進することができます。

The specific locations of double bonds in mammalian lipids have profound effects on biological membrane structure, dynamics and lipid second messenger production. Herein, we describe a shotgun lipidomics approach that exploits charge-switch derivatization with N-(4-aminomethylphenyl) pyridinium (AMPP) and tandem mass spectrometry for identification and quantification of fatty acid double bond positional isomers. Through charge-switch derivatization of fatty acids followed by positive-ion mode ionization and fragmentation analysis, a marked increase in analytic sensitivity (low fmol/μL) and the identification of double bond positional isomers can be obtained. Specifically, the locations of proximal double bonds in AMPP-derivatized fatty acids are identified by diagnostic fragment ions resulting from the markedly reduced 1,4-hydrogen elimination from the proximal olefinic carbons. Additional fragmentation patterns resulting from allylic cleavages further substantiated the double bond position assignments. Moreover, quantification of fatty acid double bond positional isomers is achieved by the linear relationship of the normalized intensities of characteristic fragment ions vs the isomeric compositions of discrete fatty acid positional isomers. The application of this approach for the analysis of fatty acids in human serum demonstrated the existence of two double bond isomers of linolenic acid (i.e., Δ(6,9,12) 18:3, γ-linolenic acid (GLA), and Δ(9,12,15) 18:3, α-linolenic acid (ALA)). Remarkably, the isomeric ratio of GLA vs ALA esterified in neutral lipids was 3-fold higher than the ratio of their nonesterified moieties. Through this developed method, previously underestimated or unidentified alterations in fatty acid structural isomers can be determined facilitating the identification of novel biomarkers and maladaptive alterations in lipid metabolism during disease.