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miRNAの生合成または活動の欠陥は、発達の異常と疾患に関連しています。ショウジョウバエでは、miRNAは主にArgonaute-1にロードされており、ターゲットRNAのサイレンシングを導きます。miRNAは、miRNAがRNAIのメディエーターであるアルゴノート-2と関連する可能性があるため、miRNA経路はこの生物のRNAi経路と重複しています。単一の誘導性プロモーターがGFPタンパク質の発現とGFPシーケンスに完全に一致する2つのmiRNAを指示する遺伝子構築物を設定します。結果として得られるAutomig遺伝子の自己サイレンシングには、抗GFP miRNAを搭載したDrosha、Pasha、Dicer-1、Dicer-2、Argonaute-2が必要であることを示します。対照的に、Automig遺伝子の自己サイレンシングには、Argonaute-1が含まれません。したがって、AutomigはmiRNA生合成とAgo-2を介したサイレンシングの両方について生体内で報告し、miRNAまたはsiRNA経路が損なわれる状況を特定するための強力なバイオセンサーを提供します。概念の証明として、私たちはAutomigをバイオセンサーとして化学ライブラリのスクリーニングとして使用し、miRNAサイレンシングを強く阻害する29の分子を特定しました。最後に、Automigセンサーは、HeLa細胞の抗GFP miRNAによっても自己サイエル化されており、哺乳類の完全な標的相補性に導かれるmiRNA生合成とサイレンシングに関与する要因を簡単に特定するために簡単に使用できます。
miRNAの生合成または活動の欠陥は、発達の異常と疾患に関連しています。ショウジョウバエでは、miRNAは主にArgonaute-1にロードされており、ターゲットRNAのサイレンシングを導きます。miRNAは、miRNAがRNAIのメディエーターであるアルゴノート-2と関連する可能性があるため、miRNA経路はこの生物のRNAi経路と重複しています。単一の誘導性プロモーターがGFPタンパク質の発現とGFPシーケンスに完全に一致する2つのmiRNAを指示する遺伝子構築物を設定します。結果として得られるAutomig遺伝子の自己サイレンシングには、抗GFP miRNAを搭載したDrosha、Pasha、Dicer-1、Dicer-2、Argonaute-2が必要であることを示します。対照的に、Automig遺伝子の自己サイレンシングには、Argonaute-1が含まれません。したがって、AutomigはmiRNA生合成とAgo-2を介したサイレンシングの両方について生体内で報告し、miRNAまたはsiRNA経路が損なわれる状況を特定するための強力なバイオセンサーを提供します。概念の証明として、私たちはAutomigをバイオセンサーとして化学ライブラリのスクリーニングとして使用し、miRNAサイレンシングを強く阻害する29の分子を特定しました。最後に、Automigセンサーは、HeLa細胞の抗GFP miRNAによっても自己サイエル化されており、哺乳類の完全な標的相補性に導かれるmiRNA生合成とサイレンシングに関与する要因を簡単に特定するために簡単に使用できます。
Defects in miRNA biogenesis or activity are associated to development abnormalities and diseases. In Drosophila, miRNAs are predominantly loaded in Argonaute-1, which they guide for silencing of target RNAs. The miRNA pathway overlaps the RNAi pathway in this organism, as miRNAs may also associate with Argonaute-2, the mediator of RNAi. We set up a gene construct in which a single inducible promoter directs the expression of the GFP protein as well as two miRNAs perfectly matching the GFP sequences. We show that self-silencing of the resulting automiG gene requires Drosha, Pasha, Dicer-1, Dicer-2 and Argonaute-2 loaded with the anti-GFP miRNAs. In contrast, self-silencing of the automiG gene does not involve Argonaute-1. Thus, automiG reports in vivo for both miRNA biogenesis and Ago-2 mediated silencing, providing a powerful biosensor to identify situations where miRNA or siRNA pathways are impaired. As a proof of concept, we used automiG as a biosensor to screen a chemical library and identified 29 molecules that strongly inhibit miRNA silencing, out of which 5 also inhibit RNAi triggered by long double-stranded RNA. Finally, the automiG sensor is also self-silenced by the anti-GFP miRNAs in HeLa cells and might be easily used to identify factors involved in miRNA biogenesis and silencing guided by perfect target complementarity in mammals.
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