機能的に最適化された相補性を決定する領域を備えた新しい重いドメイン抗体ライブラリー

今日、さまざまな形式の多くの合成抗体ライブラリが作成され、多数の組換え抗体の選択に使用されています。ライブラリからの組換え抗体の分離を成功させるための決定要因の1つは、ライブラリの品質、つまりライブラリに含まれる正しく折りたたまれた機能的抗体の数にあります。ここでは、Predatorと呼ばれる新規で高品質の合成単一ドメイン抗体ライブラリーの構築について説明します。ライブラリは、ドメイン抗体の折り畳み特性と凝集性の傾向に重要な位置でのアミノ酸組成に関する最近報告された変異を添加したHEL4ドメイン抗体に基づいています。ユニークな特徴として、ライブラリのCDR3は、CDR3の多様性に対する機能的抗体で知られていることが知られているアミノ酸を指定することにより、天然のヒト免疫応答を模倣するように設計されました。停止コドンの存在を避けるために、Trinucleotide合成を使用してCDRのランダム化を実施しました。さらに、ランダム化CDRを含む合成された単一鎖DNAをライブラリの二重鎖DNAに変換するために、新しいサイクルフリー伸長法を使用しました。さらに、各CDR領域に一意の制限サイトが隣接する足場にモジュール式アプローチが採用されており、CDRシャッフルによる選択されたクローンのアフィニティ成熟が容易になります。ライブラリの品質を検証するために、1つの丸いファージディスプレイの選択が、精製された抗原と、培養された真核細胞などの非常に複雑な抗原混合物で行われ、いくつかの特定のバインダーが生じました。ただし、選択されたクローンの一部のさらなる特性評価は、HEL4足場への追加の変異を含めることによって引き起こされる熱力学的安定性の低下を示しています。

Today a number of synthetic antibody libraries of different formats have been created and used for the selection of a large number of recombinant antibodies. One of the determining factors for successful isolation of recombinant antibodies from libraries lies in the quality of the libraries i.e. the number of correctly folded, functional antibodies contained in the library. Here, we describe the construction of a novel, high quality, synthetic single domain antibody library dubbed Predator. The library is based on the HEL4 domain antibody with the addition of recently reported mutations concerning the amino acid composition at positions critical for the folding characteristics and aggregation propensities of domain antibodies. As a unique feature, the CDR3 of the library was designed to mimic the natural human immune response by designating amino acids known to be prevalent in functional antibodies to the diversity in CDR3. CDR randomizations were performed using trinucleotide synthesis to avoid the presence of stop codons. Furthermore a novel cycle free elongation method was used for the conversion of the synthesized single stranded DNA containing the randomized CDRs into double stranded DNA of the library. In addition a modular approach has been adopted for the scaffold in which each CDR region is flanked by unique restrictions sites, allowing easy affinity maturation of selected clones by CDR shuffling. To validate the quality of the library, one round phage display selections were performed on purified antigens and highly complex antigen mixtures such as cultured eukaryotic cells resulting in several specific binders. The further characterization of some of the selected clones, however, indicates a reduction in thermodynamic stability caused by the inclusion the additional mutations to the HEL4 scaffold.