速度論的同位体効果は、PIN1ペプチジルプロリルイソメーゼのねじれたアミドメカニズムをサポートします

PIN1ペプチジルプロリルイソメラーゼは、細胞周期の調節におけるPSER/PTHR-PROモチーフの異性化を触媒します。ペプチド基質であるAc-Phe-Phe-Phe-Phe-Phosphoser-Pro-ARG-P-ニトロアニリンは、無標識形態で合成され、Deuterium標識Ser-D3およびPro-D7アミノ酸を使用しました。運動データは、触媒効率（KCAT/km）に対する運動同位体効果（KIE）を測定するために、PIN1濃度の関数として収集されました。Ser-D3基質（kh/kd = 1.6±0.2）に対して測定された通常の二次（2°）Kie値は、セリンカルボニルが速度決定ステップでsp（2）からsp（3）に再bridizeしないことを示しています。求核性添加メカニズムを排除します。通常の2°KIEは、Serα-C-H/DとC═Oの間の過結合と、CISからSyn-Exoへのアミド結合の回転時の立体株の放出によって説明できます。pro-d7基質について測定された逆2°Kie値（kh/kd = 0.86±0.08）は、異性化の速度制限段階でのSp（2）からSp（3）へのプロリル窒素の再bridizationを示しています。NMR交換分光法（KH2O/KD2O = 0.92±0.12）によって溶媒運動同位体は測定されておらず、メカニズムにおける交換可能な陽子の関与はほとんどまたはまったく関与していないことを示しています。これらの結果は、PIN1によって触媒されるペプチジルプロリル異性化のメカニズムとしての単純なねじれたアミド遷移状態の形成をサポートします。反応メカニズムのモデルは、基底状態の類似体とねじれたアミド遷移状態に似た阻害剤を備えたPIN1の結晶構造を使用して提示されます。

The Pin1 peptidyl-prolyl isomerase catalyzes isomerization of pSer/pThr-Pro motifs in regulating the cell cycle. Peptide substrates, Ac-Phe-Phe-phosphoSer-Pro-Arg-p-nitroaniline, were synthesized in unlabeled form, and with deuterium-labeled Ser-d3 and Pro-d7 amino acids. Kinetic data were collected as a function of Pin1 concentration to measure kinetic isotope effects (KIEs) on catalytic efficiency (kcat/Km). The normal secondary (2°) KIE value measured for the Ser-d3 substrate (kH/kD = 1.6 ± 0.2) indicates that the serine carbonyl does not rehybridize from sp(2) to sp(3) in the rate-determining step, ruling out a nucleophilic addition mechanism. The normal 2° KIE can be explained by hyperconjugation between Ser α-C-H/D and C═O and release of steric strain upon rotation of the amide bond from cis to syn-exo. The inverse 2° KIE value (kH/kD = 0.86 ± 0.08) measured for the Pro-d7 substrate indicates rehybridization of the prolyl nitrogen from sp(2) to sp(3) during the rate-limiting step of isomerization. No solvent kinetic isotope was measured by NMR exchange spectroscopy (kH2O/kD2O = 0.92 ± 0.12), indicating little or no involvement of exchangeable protons in the mechanism. These results support the formation of a simple twisted amide transition state as the mechanism for peptidyl prolyl isomerization catalyzed by Pin1. A model of the reaction mechanism is presented using crystal structures of Pin1 with ground state analogues and an inhibitor that resembles a twisted amide transition state.