ハーフライフエクステンションのためにクリック可能な血清アルブミンモジュールを使用した、設計されたアンキリンリピートタンパク質毒素コンジュゲートの直交アセンブリ

安全で効果的な腫瘍標的のための薬物抱合剤の生成には、合理的な工学による機能化に耐性の結合タンパク質が必要です。ここでは、抗体に由来しない結合タンパク質の新規クラスであるAnkyrinリピートタンパク質（DARPIN）が、カスタマイズされた特性を使用した腫瘍ターゲティングの生物凝集体の容易な直交アセンブリの構成要素として使用できることを示しています。上皮細胞接着分子（EPCAM）を標的とするDARPIN EC1は、小分子細胞毒素モノメチルアウリスタチンF（MMAF）の共役のためにC末端システインで遺伝的に修飾されました。さらに、Cu（I）-Free Click化学を使用した半減期拡張のために、部位特異的にジベンゾシクロクチン修飾マウス血清アルブミン（MSA）の連鎖を可能にするために、非自然なアミノ酸アジドホモアラニンの代謝導入によってN末端に機能化されました。コンジュゲートMSA-EC1-MMAFは、さまざまな分析方法および機能的アッセイによって確認されたように、純粋で安定した薬物共役の高収量を得るために組み立てられました。アセンブリの直交性は、定義された反応生成物につながり、EPCAM固有の結合と内在化、MSAによって媒介されるFCRN結合、および細胞毒性効力など、すべてのモジュールの機能特性を保存しました。MMAFのダルピンへの結合は、非特異的な取り込みを減少させながら、薬物の受容体特異的摂取量を増加させ、MSAへのコンジュゲートのさらなる結合により、この効果が向上しました。マウスでは、アルブミンの結合が血清半減期を11分から17.4時間に増加させ、地域の領域（AUC）が22倍以上増加しました。私たちのデータは、腫瘍標的のための薬物動態性能の向上を伴う薬物コンジュゲートの容易なモジュラーアセンブリのためのDarpin形式の約束を示しています。

The generation of drug conjugates for safe and effective tumor targeting requires binding proteins tolerant to functionalization by rational engineering. Here, we show that Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins), a novel class of binding proteins not derived from antibodies, can be used as building blocks for facile orthogonal assembly of bioconjugates for tumor targeting with tailored properties. DARPin Ec1, which targets the Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM), was genetically modified with a C-terminal cysteine for conjugation of the small molecule cytotoxin monomethylauristatin F (MMAF). In addition, it was N-terminally functionalized by metabolic introduction of the non-natural amino acid azidohomoalanine to enable linkage of site-specifically dibenzocyclooctyne-modified mouse serum albumin (MSA) for half-life extension using Cu(I)-free click chemistry. The conjugate MSA-Ec1-MMAF was assembled to obtain high yields of a pure and stable drug conjugate as confirmed by various analytical methods and in functional assays. The orthogonality of the assembly led to a defined reaction product and preserved the functional properties of all modules, including EpCAM-specific binding and internalization, FcRn binding mediated by MSA, and cytotoxic potency. Linkage of MMAF to the DARPin increased receptor-specific uptake of the drug while decreasing nonspecific uptake, and further coupling of the conjugate to MSA enhanced this effect. In mice, albumin conjugation increased the serum half-life from 11 min to 17.4 h, resulting in a more than 22-fold increase in the area-under-the-curve (AUC). Our data demonstrate the promise of the DARPin format for facile modular assembly of drug conjugates with improved pharmacokinetic performance for tumor targeting.