抗CD14抗体は、ヒト単球のTLR4内在化を介してLPS応答性を低下させます

CD14は、主に単球で発現するLPSセンシング受容体です。CD14は、バクテリアのLPSを表面TLR4：MD-2複合体に結合および転送して、その認識を可能にします。LPSを認識した後、この複合体はTiRapとMyD88を介して最初の細胞内シグナルを生成し、その後表面TLR4/LPS複合体が急速に内在化され、TRAMとTRIFを介して追加のシグナルを生成します。CD14は、LPS誘導TLR4エンドサイトーシスと2番目のシグナル伝達の重要な調節因子であることが最近示唆されました。本研究では、ヒト一次単球および細胞株THP-1の表面TLR4発現が抗CD14 ABで治療した後に有意に減少することを示しました。この研究で使用されている異なるエピトープ特異性を持つ3つの抗CD14 ABSのうち、CD14分子のLPS結合ドメインのエピトープ特異性を持つMY4は、CD14と同様にTLR4の表面発現の低下に最も強力であることがわかりました。この削減の理由をテストするために、毒素と結合した抗TLR4 ABを使用してin vitro内在化アッセイを実行しました。この分析の結果は、表面CD14ライゲーション媒介TLR4内在化を示し、内在化のメカニズムは部分的にクラスリン依存性であることがわかった。次に、MY4前処理の有無にかかわらずLPSチャレンジに応答したTHP-1xBlue-CD14細胞のNF-κB/AP-1活性化とTNF-α産生を調べました。結果は、MY4で処理した細胞のNF-κB/AP-1の活性化とTNF-α産生が対照と比較した場合、著しく損なわれたことを明らかにしました。我々の結果は、膜CD14ライゲーションを介したTLR4内在化が、TLR4の表面発現の効果的なダウンレギュレーションおよびその後のヒト単球のLPS応答の減少のための新しいメカニズムであることを示唆しています。

CD14 is an LPS sensing receptor that is primarily expressed in monocytes. CD14 binds and transfers bacterial LPS to the surface TLR4:MD-2 complex to enable its recognition. After recognizing LPS, this complex produces the first intracellular signals via TIRAP and MyD88, after which surface TLR4/LPS complex is rapidly internalized and produces additional signals via TRAM and TRIF. It was recently suggested that CD14 is a key regulator of LPS-induced TLR4 endocytosis and second signaling. In the present study, we showed that surface TLR4 expressions of human primary monocytes and cell line THP-1 were significantly reduced after treatment with anti-CD14 Ab. Among three anti-CD14 Abs with different epitope specificities used in this study, My4, which has an epitope specificity for LPS binding domain of the CD14 molecule, was found to be the most potent at reduction of surface expression of TLR4 as well as CD14. To test the reason for this reduction, we performed an in vitro internalization assay using anti-TLR4 Ab conjugated with toxin. The results of this analysis indicated surface CD14 ligation-mediated TLR4 internalization, and the mechanism of the internalization was found to be partially clathrin-dependent. We next examined NF-κB/AP-1 activation and TNF-α production of THP-1XBlue-CD14 cells in response to LPS challenge with or without My4 pre-treatment. The results revealed that NF-κB/AP-1 activation and TNF-α production of cells treated with My4 were significantly impaired when compared to the control. Our results suggest that membrane CD14 ligation-mediated TLR4 internalization is a novel mechanism for effective down-regulation of surface expression of TLR4 and subsequent reduction of LPS response of human monocytes.