大規模な並列反応モニタリング分析のための技術的な考慮事項

非標識：ターゲットを絞った方法は、定量的実験を行うためにプロテオミクスコミュニティの間で受け入れられています。ただし、そのような実験を行うための現在の参照は、いくつかの制限に苦しんでいますが、トリプル四重極質量分析計で実行された選択された反応モニタリング（SRM）分析に依存しています。第一に、低解像度の四重極質量分析装置は、生物学的サンプルで一般的に遭遇する干渉から分析物を区別するのに十分な選択性を提示しません。第二に、1つの実験で監視されているペプチドの数は、しばしば限られたままです。高速シーケンス機能を備えた高解像度/正確な質量機器の導入により、新しい定量的方法の開発が可能になりました。より具体的には、並列反応モニタリング（PRM）モードで動作する新しい四重極軌道質量分析計は、高解像度の軌道大量分析装置の選択性の増加により、SRMで得られた検出と定量化パフォーマンスをSRMで得たものと同様またはそれ以上に示しました。機器の汎用性は、前駆体イオンの選択を多重化し、さまざまな四重極分離ウィンドウで動作する能力により、大規模な実験の設計を可能にし、高性能を維持するためにいくつかの取得パラメーターの最適化が必要です。これには、トラッピングデバイスの充填時間の調整と、ペプチドの溶出時間の緊密なスケジューリングが含まれ、理想的にはフライで調整されています。 生物学的意義：本研究は、四重極軌道機器で行われた大規模並列反応モニタリング（PRM）実験における感度と分析されたペプチドの数との間のトレードオフをよりよく制御するためのプロテオミクスコミュニティにとって貴重なベースラインを構成しています。標準の取得方法では、パラメーターの慎重な設定、つまり、一方の手の解像度の制御と多重化の程度、および他方の手の四重極選択ウィンドウに従って充填時間を必要とします。この研究は、十分な感度を維持しながら、大規模なPRM実験の獲得パラメーターを確立するのに役立ちます。さらに、スケジュールされたペプチド監視ウィンドウのリアルタイム補正は、溶出時間の漂流を補うために調査されました。このアプローチは、PRM分析で狭められた監視ウィンドウの使用をサポートしており、単一のLC-MS実験で標的となったペプチドの数を大幅に拡大します。コミュニティが提示されたアプローチの広範な適用は、ターゲットプロテオミクスの前例のないスケールの確立を可能にする可能性が高く、システム生物学またはバイオマーカー評価研究の差し迫った需要と一致します。この記事は、次の特別号の一部です。プロテオミクスはゲノミクスと表現型のギャップを埋めることができますか？

UNLABELLED: Targeted methods have gained acceptance among proteomics community to perform quantitative experiments. However, the current reference to conduct such experiments relies on selected reaction monitoring (SRM) analyses performed on triple quadrupole mass spectrometers, although it suffers from some limitations. First, the low resolution quadrupole mass analyzers do not present enough selectivity to discriminate the analytes from interferences commonly encountered in biological samples. Second, the number of peptides monitored in one single experiment often remains limited. The introduction of high resolution/accurate mass instruments with fast sequencing capabilities has enabled the development of novel quantitative methods. More specifically, the new quadrupole-orbitrap mass spectrometer operated in parallel reaction monitoring (PRM) mode showed detection and quantification performances similar or better than those obtained in SRM, due to the increased selectivity of the high-resolution orbitrap mass analyzer. The versatility of the instrument, with its ability to multiplex the selection of precursor ions and to operate with varying quadrupole isolation windows, has enabled the design of large-scale experiments, which require the optimization of several acquisition parameters to maintain high performance. It includes the adjustments of the fill time of the trapping device and the tight scheduling of elution times of the peptides, ideally adjusted on-the-fly. BIOLOGICAL SIGNIFICANCE: The present study constitutes a valuable baseline for the proteomics community to better control the trade-off between sensitivity and number of analyzed peptides in large-scale parallel reaction monitoring (PRM) experiments performed on a quadrupole-orbitrap instrument. A standard acquisition method requires careful setting of the parameters, namely the fill time in accordance with the control of the resolving power and the degree of multiplexing on one hand, and the quadrupole selection window on the other hand. This study helps in establishing acquisition parameters for large-scale PRM experiments, while maintaining sufficient sensitivity. In addition, the real-time correction of the scheduled peptide monitoring windows, to compensate for possible elution time drift, was explored. This approach supports the use of narrowed monitoring windows in PRM analyses, which greatly scale up the number of peptides targeted in a single LC-MS experiment. The broad application of the presented approaches by the community is likely to allow the establishment of an unprecedented scale for targeted proteomics, thus matching the pressing demand of systems biology or biomarker evaluation studies. This article is part of a Special Issue entitled: Can Proteomics Fill the Gap Between Genomics and Phenotypes?