熱ショックタンパク質27リン酸化は、上皮細胞アポトーシスと角膜上皮の創傷治癒中の上皮移動に関与しています

2012年7月にマウス角膜における上皮創傷治癒中のリン酸化Hsp27の発現を報告しました。これは、in vivoの調査で、リン酸化Hsp27の発現レベルが、巻き付かれていないコントロールよりも傷ついた角膜上皮細胞の方が大きいことを示しました。また、リン酸化Hsp27の局在は、角膜上皮の傷害後3日後の基底および表在性上皮にあったこと。リン酸化HSP27が角膜上皮創傷治癒の初期段階で役割を果たしたことを示唆しました。この研究の目的は、培養ヒト角膜上皮細胞（HCEC）の創傷治癒のための熱ショックタンパク質27（HSP27）リン酸化の正確な役割を調査することでした。HSP27固有のsiRNAとコントロールシルナは、HCECに既知の相同ターゲットが作成されていません。培養HCECは、スクランブルコントロールシルナトランスフェクトグループとHSP27特異的siRNAトランスフェクトグループの2つのグループに分けられました。非リン酸化およびリン酸化Hsp27に対する抗体、非リン酸化およびリン酸化Akt、Bcl-2関連Xタンパク質（BAX）、フィラメントの免疫蛍光染色、フローシトメトリー測定染色染色染色染色染色染色染色染色染色染色染色染色染色染色染色染色染色染色、bcl-2-oflotting、スクラッチ誘発方向創傷アッセイ、ウエスタンブロッティング。アポトーシスを測定するために、およびHSP27の役割を決定するために増殖アッセイを実施しました。ウエスタンブロットアッセイは、リン酸化HSP27の発現が、傷のないHCECのものと比較して、傷の創傷後5、10、および30分で有意に増加することを示しました（すべてP <0.05）。また、ウエスタンブロットアッセイは、Hsp27特異的siRNAが非リン酸化HSP27の発現を効果的にブロックしたことを示しました。Hsp27特異的siRNAトランスフェクトグループは、より多くのBAX発現、リン酸化AKT発現が少なく、非リン酸化およびリン酸化HSP27発現が少なくなりました（すべてp <0.05）。スクラッチ誘導方向創傷アッセイは、コントロールシルナトランスフェクトグループよりも移動性が低いHsp27特異的siRNAトランスフェクトグループを示しました（P <0.05）。免疫蛍光染色により、アクチン細胞骨格の再編成は、対照siRNAトランス化されたグループと比較して、HSP27特異的siRNAトランスフェクトグループで顕著に減少することが示されました。フローサイトメトリーは、HSP27特異的siRNAトランスフェクトグループがより多くのHCECアポトーシスを持っていることを明らかにしました。増殖アッセイは、2つのグループ間に違いを示さなかった。結論として、角膜上皮の創傷治癒におけるHsp27の役割は、上皮細胞のアポトーシスと同様に上皮の移動である可能性があります。HSP27は、アクチンサイト骨格の再編成によるHCEC移動に関与しています。

We reported the expression of phosphorylated HSP27 during epithelial wound healing in murine corneas (Jain et al., 2012) in July of 2012. This in vivo investigation demonstrated that the expression levels of phosphorylated HSP27 were greater in wounded corneal epithelial cells than in unwounded controls and that the localization of phosphorylated HSP27 was in the basal and superficial epithelia three days following corneal epithelial wounding. We suggested that phosphorylated HSP27 had a role in the early phase of corneal epithelial wound healing. The purpose of this study was to investigate the exact role of heat shock protein 27 (HSP27) phosphorylation for the wound healing of cultured human corneal epithelial cells (HCECs). HSP27-specific siRNAs and control-siRNAs, with no known homologous targets in HCECs, were created. The cultured HCECs were divided into two groups: Scrambled control-siRNA-transfected group vs. HSP27-specific siRNA-transfected group. The scratch-induced directional wounding assay, Western blotting, using antibodies against non-phosphorylated and phosphorylated HSP27, non-phosphorylated and phosphorylated Akt, and Bcl-2-associated X protein (Bax), immunofluorescence staining to determine the filament actin, flow cytometry to measure apoptosis, and proliferation assay were performed to determine the role of HSP27. Western blot assay showed that the expression of phosphorylated HSP27 significantly increased at 5, 10, and 30 min after scratch wounding, compared with those in unwounded HCECs (all p < 0.05). Western blot assay also showed HSP27-specific siRNAs effectively blocked the expression of non-phosphorylated HSP27. The HSP27-specific siRNA-transfected group had more Bax expression, less phosphorylated Akt expression, and less non-phosphorylated and phosphorylated HSP27 expression (all p < 0.05). The scratch-induced directional wounding assay showed the HSP27-specific siRNA-transfected group with a less migrating cell number than the control-siRNA-transfected group (p < 0.05). Immunofluorescence staining showed that reorganization of actin cytoskeleton prominently decreased in the HSP27-specific siRNA-transfected group, compared with the control siRNA-tranfected group. Flow cytometry revealed that the HSP27-specific siRNA-transfected group had more HCEC apoptosis. Proliferation assay showed no difference between the two groups. In conclusion, the role of HSP27 in corneal epithelial wound healing can be epithelial cell apoptosis, as well as epithelial migration. HSP27 is involved in HCEC migration by the reorganization of actin cytoskeleton.