高解像度の溶融分析による結核菌のピラジンアミド感受性試験

ピラジナミド（PZA）は、結核治療期間の短縮およびMDR-TBの治療において重要な役割を果たします。表現型PZA感受性法は、コストと複雑さを増加させる特殊な酸性媒体を必要とするため、制限されています。この研究では、PZA耐性マイコバクテリウム結核に関連するPNCA変異を検出するための遺伝子型高解像度Melt（HRM）分析技術を開発しました。PNCA遺伝子全体と上流領域全体をカバーするように、7つの重複するプライマーペアが設計されました。各遺伝子セグメントは、リアルタイムPCRに続いてHRM分析によって個別に増幅されました。このアッセイは、98の臨床的M.結核分離株で評価されました（MGIT法による41 PZA感受性、55 PZA耐性、2つの未定）。HRMは、フルレングスのシーケンス結果と一致して94％であり、HRMまたはトランジョンあたりの混合集団に起因するほとんどの矛盾がありました。シーケンスとHRMは、それぞれMGITによる表現型PZA感受性に対して82％および84％の一致をもたらし、ほとんどの矛盾は野生型PNCAであるが表現型PZA耐性を持つ分離株に起因します。このHRM技術は、PZA耐性のための臨床M.結核サンプルをスクリーニングするためのシンプルでハイスループットの方法です。

Pyrazinamide (PZA) plays the important role in shortening the tuberculosis treatment period and in treating MDR-TB. Phenotypic PZA susceptibility methods are limited because they require specialized acidified media, which increases costs and complexity. In this study we developed a genotypic high resolution melt (HRM) analysis technique to detect pncA mutations associated with PZA resistant Mycobacterium tuberculosis. Seven overlapping primer pairs were designed to cover the entire pncA gene and upstream regions. Each gene segment was individually amplified by real-time PCR followed by HRM analysis. The assay was evaluated on 98 clinical M. tuberculosis isolates (41 PZA susceptible by MGIT method, 55 PZA resistant, 2 undetermined). HRM was 94% concordant to full-length sequencing results, with most discrepancies attributable to mixed populations per HRM or transversions. Sequencing and HRM yielded 82% and 84% concordance, respectively, to phenotypic PZA susceptibilities by MGIT, with most discrepancies attributable to isolates with wild-type pncA but phenotypic PZA resistance. This HRM technique is a simple and high-throughput method for screening clinical M. tuberculosis samples for PZA resistance.