2つの独立したアライメントマーカーを使用した高精度相関蛍光と電子凍結顕微鏡

相関光および電子顕微鏡（CLEM）は、蛍光顕微鏡（FM）によって提供される機能情報と電子顕微鏡の高解像度構造情報（EM）を組み合わせた新興技術です。これまでのところ、凍結水素化されたサンプルの相関クライオ顕微鏡は、マイクロメートル範囲の精度よりも良く到達していません。ここでは、蛍光タグ付けされたタンパク質とナノメートル範囲の精度を備えたElectron Cryo断層撮影（CRYOET）データとの相関を可能にする方法が提示されています。具体的には、ガラス化された全細胞の薄い領域は、相関蛍光極度顕微鏡（CRYOFM）およびCRYOETによって検査されます。提示されたクリオクレムワークフローの新しい側面には、2つの独立した電子密度の高い蛍光マーカーの実装が含まれるだけでなく、アライメントの精度を改善するだけでなく、関心のある個々のオブジェクトの相関精度の推定値を取得する能力も含まれます。プランジフリーズからクレオエットまでの相関ワークフローは、細胞内で人身売買する蛍光で覆われたアデノウイルス粒子を見つける例のために、詳細な段階的なステップです。

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is an emerging technique which combines functional information provided by fluorescence microscopy (FM) with the high-resolution structural information of electron microscopy (EM). So far, correlative cryo microscopy of frozen-hydrated samples has not reached better than micrometre range accuracy. Here, a method is presented that enables the correlation between fluorescently tagged proteins and electron cryo tomography (cryoET) data with nanometre range precision. Specifically, thin areas of vitrified whole cells are examined by correlative fluorescence cryo microscopy (cryoFM) and cryoET. Novel aspects of the presented cryoCLEM workflow not only include the implementation of two independent electron dense fluorescent markers to improve the precision of the alignment, but also the ability of obtaining an estimate of the correlation accuracy for each individual object of interest. The correlative workflow from plunge-freezing to cryoET is detailed step-by-step for the example of locating fluorescence-labelled adenovirus particles trafficking inside a cell.