ヒト角膜内皮細胞の伝播：新しいデュアルメディアアプローチ

角膜内皮に関連する角膜失明は、角膜移植の最も一般的な兆候です。回復型の角膜移植手術は、失明を逆転させる唯一の選択肢ですが、ドナー材料の世界的な不足は依然として問題です。ドナー材料への現在の依存を緩和するための代替治療戦略の開発には、計り知れない臨床的関心があります。このような努力のために、ヒト角膜内皮細胞（HCEC）のex vivo伝播が必要ですが、現在の方法論には一貫性がなく、HCECの拡大は間葉系様形質転換への細胞形態を失います。この研究では、一次HCECのin vitro拡張に関する新しいデュアルメディア文化アプローチについて説明します。初期の特性評価には、増殖（M4）または維持（M5）培地のいずれかで成長したHCECの成長ダイナミクスの分析が含まれていました。デュアルメディアアプローチを使用して拡張された細胞に対してM4のみで培養された分離されたHCECで、その後の比較を実行しました。免疫細胞化学、定量的リアルタイムPCR、および遺伝子発現マイクロアレイを使用して、さらなる特性を実施しました。3番目の箇所で、結果は、デュアルメディアアプローチを使用して伝播されたHCECが外観が均一であり、独自の多角形の細胞形態を保持し、M4単独で培養されたHCECと比較してより高いレベルの角膜内皮関連マーカーを発現し、ゼロゼーションであり、ゼロゼネであり、外観が線維芽細胞。最後に、デュアルメディアアプローチを使用して培養されたHCECの場合、M5への7日間の曝露の前後のコンフルエントなHCEC間のグローバルな遺伝子発現と経路分析は、細胞増殖と創傷治癒に主に関連する微分遺伝子発現を示しました。これらの発見は、この研究で提示された新しいデュアルメディアアプローチを使用した一次HCECの伝播が、真正なHCECを得るための一貫した方法であることを示しました。これは、組織工学移植片材料または細胞注射療法を使用して、代替角膜内皮置換術の下流の発達を促進することに、より大きな自信を引き出します。

Corneal endothelium-associated corneal blindness is the most common indication for corneal transplantation. Restorative corneal transplant surgery is the only option to reverse the blindness, but a global shortage of donor material remains an issue. There are immense clinical interests in the development of alternative treatment strategies to alleviate current reliance on donor materials. For such endeavors, ex vivo propagation of human corneal endothelial cells (hCECs) is required, but current methodology lacks consistency, with expanded hCECs losing cellular morphology to a mesenchymal-like transformation. In this study, we describe a novel dual media culture approach for the in vitro expansion of primary hCECs. Initial characterization included analysis of growth dynamics of hCECs grown in either proliferative (M4) or maintenance (M5) medium. Subsequent comparisons were performed on isolated hCECs cultured in M4 alone against cells expanded using the dual media approach. Further characterizations were performed using immunocytochemistry, quantitative real-time PCR, and gene expression microarray. At the third passage, results showed that hCECs propagated using the dual media approach were homogeneous in appearance, retained their unique polygonal cellular morphology, and expressed higher levels of corneal endothelium-associated markers in comparison to hCECs cultured in M4 alone, which were heterogeneous and fibroblastic in appearance. Finally, for hCECs cultured using the dual media approach, global gene expression and pathway analysis between confluent hCECs before and after 7-day exposure to M5 exhibited differential gene expression associated predominately with cell proliferation and wound healing. These findings showed that the propagation of primary hCECs using the novel dual media approach presented in this study is a consistent method to obtain bona fide hCECs. This, in turn, will elicit greater confidence in facilitating downstream development of alternative corneal endothelium replacement using tissue-engineered graft materials or cell injection therapy.