ポドプラニンは、プレセニリン-1/γ-セクレターゼの基質です

ポドプラニン（PDPN）は、発達と癌において重要な役割を果たすムチン様膜貫通糖タンパク質です。ここでは、ポドプラニンの細胞内ドメイン（ICD）がメタロプロテアーゼとγ-セクレターゼによる連続的なタンパク質分解に続いてサイトゾルに放出されるという証拠を提供します。ウエスタンブロッティングおよび細胞分画の研究により、HEK293TおよびMDCK細胞は、EGFPタグ付きポドプラニンコンストラクト（PDPNEGFP、50-63KDA）をトランスフェクトしたことが明らかになりました。サイトゾルポドプラニンICD（PICD）。メタロプロテアーゼの薬理学的阻害はPCTF33の発現を減少させましたが、γ-セクレターゼ阻害剤で細胞の治療によりPCTF33レベルが増加しました。γ-セクレターゼによるPCTF33処理は、プレセニリン-1（PS1）機能：PS1（PS1 D385N）の支配的な陰性型を発現する細胞、およびPS1では遺伝的に不足しているマウス胚性線維芽細胞（MEF）を発現する細胞に依存します。野生型MEFに関するPCTF33発現。さらに、野生型PS1（PS1 wt）によるPS1欠損MEFのトランスフェクションは、PCTF33レベルを低下させました。アフィニティ精製PICDのN末端アミノ酸配列決定により、γ-セクレターゼ切断部位はバライン150から151の間に位置していることが明らかになりましたが、これらの残基はタンパク質分解に重要ではありません。ポドプラニンCTFは、異種膜貫通領域を抱えるポドプラニン変異体を発現する細胞でも生成されることがわかりました。まとめると、これらの結果は、ポドプラニンがPS1/γ-セクレターゼの新規基質であることを示しています。

Podoplanin (PDPN) is a mucin-like transmembrane glycoprotein that plays an important role in development and cancer. Here, we provide evidence that the intracellular domain (ICD) of podoplanin is released into the cytosol following a sequential proteolytic processing by a metalloprotease and γ-secretase. Western blotting and cell fractionation studies revealed that HEK293T and MDCK cells transfected with an eGFP-tagged podoplanin construct (PDPNeGFP, 50-63kDa) constitutively express two C-terminal fragments (CTFs): a ∼33kDa membrane-bound PCTF33, and a ∼29kDa cytosolic podoplanin ICD (PICD). While pharmacological inhibition of metalloproteases reduced the expression of PCTF33, treatment of cells with γ-secretase inhibitors resulted in enhanced PCTF33 levels. PCTF33 processing by γ-secretase depends on presenilin-1 (PS1) function: cells expressing a dominant negative form of PS1 (PS1 D385N), and mouse embryonic fibroblasts (MEFs) genetically deficient in PS1, but not in PS2, show higher levels of PCTF33 expression with respect to wild-type MEFs. Furthermore, transfection of PS1 deficient MEFs with wild-type PS1 (PS1 wt) decreased PCTF33 levels. N-terminal amino acid sequencing of the affinity purified PICD revealed that the γ-secretase cleavage site was located between valines 150 and 151, but these residues are not critical for proteolysis. We found that podoplanin CTFs are also generated in cells expressing podoplanin mutants harboring heterologous transmembrane regions. Taken together, these results indicate that podoplanin is a novel substrate for PS1/γ-secretase.