遺伝子送達のための多重層カーボンナノチューブとアミノ修飾線形プラスミドDNAの共有結合生物凝集物質

カーボンナノチューブ（CNT）は、独自の物理的、機械的、電子的特性を備えた炭素の同種です。さまざまな生物医学用途の中で、CNTは非ウイルス遺伝子送達システムとしても関心を集めています。カチオン基を使用したCNTの機能化により、負に帯電したDNAを細胞に送達することができます。DNA送達に関するこのよく知られた戦略とは対照的に、私たちのアプローチには、直線化されたプラスミドDNAのカルボキシル化マルチウールCNT（MWCNT）への共有結合付着が含まれていました。カルボキシル基は酸化処理によりMWCNTに導入され、その後、カルボキシル基は1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジミド（EDC）によって活性化されました。緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードする遺伝子を含むPQE-70ベクター全体を、修飾ヌクレオチドN6-（6-アミノ）ヘキシル-2'-デオキシアデノシン-5'-トリポスホ酸を使用してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）にかけました。したがって、遊離アミノ基は線形化されたプラスミドに導入されました。アミノ修飾プラスミドDNAとカルボキシル化MWCNTの間の共有結合は、EDC化学を介して達成されました。得られた生物凝ジュゲートは、42°Cでの熱ショックステップを必要とせずに、化学的に有能な大腸菌細胞に成功裏に変換されました。形質転換培地におけるCa（2+）の存在は、DNAと大腸菌の負に帯電した外層との間の静電反発を中和するために必要でした。GFPを発現できる形質転換体は、アンピシリン寒天プレートで手動で検査されました。私たちの研究は、他の非共有CNT遺伝子送達システムに関する斬新さを表しています。線形DNAフラグメントの送達への関心を考慮すると、私たちの研究はさらなる研究に関する洞察を与える可能性があります。

Carbon nanotubes (CNTs) are allotropes of carbon, which have unique physical, mechanical, and electronic properties. Among various biomedical applications, CNTs also attract interest as nonviral gene delivery systems. Functionalization of CNTs with cationic groups enables delivery of negatively charged DNA into cells. In contrast to this well-known strategy for DNA delivery, our approach included the covalent attachment of linearized plasmid DNA to carboxylated multiwalled CNTs (MWCNTs). Carboxyl groups were introduced onto MWCNTs by oxidative treatment, and then the carboxyl groups were activated by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC). The whole pQE-70 vector including the gene encoding green fluorescent protein (GFP) was subjected to polymerase chain reaction (PCR) using the modified nucleotide N6-(6-Amino)hexyl-2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate. Hence, free amino groups were introduced onto the linearized plasmid. Covalent bonding between the amino-modified plasmid DNA and the carboxylated MWCNTs was achieved via EDC chemistry. The resulting bioconjugate was successfully transformed into chemically competent Escherichia coli cells, without necessity of a heat-shock step at 42°C. The presence of Ca(2+) in transformation medium was required to neutralize the electrostatic repulsion between DNA and negatively charged outer layer of E. coli. The transformants, which were able to express GFP were inspected manually on ampicillin agar plates. Our study represents a novelty with respect to other noncovalent CNT gene delivery systems. Considering the interest for delivery of linear DNA fragments, our study could give insights into further studies.