液体クロマトグラフィータンデム質量分析によるヒト血漿中のɛ-N-カルボキシメチル-L-リジンの定量的測定

ɛ-N-カルボキシメチル-L-リジン（CML）は、糖化と酸化反応に起因するタンパク質リジン残基の安定した化学的修飾、および糖と脂質酸化によって引き起こされる酸化ストレスの潜在的なバイオマーカーです。この研究では、ヒト血漿中のCMLの測定のための液体クロマトグラフィータンデム分析（LC-MS/MS）に基づく迅速でシンプルかつ敏感な方法が開発および検証されています。サンプルの調製には、内部標準として重水素化CMLを添加した後のトリクロロ酢酸を使用したタンパク質沈殿が含まれていました。クロマトグラフィーは、アセトニトリルを含む移動相：超純水（80:20、v/v）を含む勾配溶出によりアミノカラムで行われました。CMLとCML-D2は、それぞれ205.0/130.1および207.2/84.1を使用した複数の反応モニタリングモードで検出されました。アッセイは、10〜1000 ng/mlの範囲で線形であり、10 ng/mLの定量（LLOQ）、回復> 90％の定量（LLOQ）。アッセイの検証により、日中および日中の精度と精度が満足のいくものであることが示されました。この方法は、健康な中国の被験者と糖尿病および尿血症患者の血漿CMLレベルを比較するために適用されました。健康な被験者では、CML濃度（平均±SD）は16.6±7.8 ng/mlでした。糖尿病患者のCMLレベルは健康な被験者と有意な差はありませんでしたが、尿症患者のレベルは健康な被験者と糖尿病患者の両方よりも有意に高かった（P <0.001）。この方法は、酸化ストレスの上昇に起因する糖尿病性血管合併症のバイオマーカーとしてのCMLの値を評価するのに役立ちます。

ɛ-N-carboxymethyl-L-lysine (CML) is a stable chemical modification of protein lysine residues resulting from glycation and oxidation reactions and a potential biomarker of oxidative stress caused by sugar and lipid oxidation. In this study, a rapid, simple and sensitive method based on liquid chromatography-tandem spectrometry (LC-MS/MS) for the determination of CML in human plasma has been developed and validated. Sample preparation involved protein precipitation using trichloroacetic acid after addition of deuterated CML as internal standard. Chromatography was performed on an amino column by gradient-elution with a mobile phase containing acetonitrile:ultrapure water (80:20, v/v). CML and CML-d2 were detected by multiple reaction monitoring mode with ion pairs 205.0/130.1 and 207.2/84.1 respectively. The assay was linear in the range 10-1000 ng/mL with a lower limit of quantitation (LLOQ) of 10 ng/mL and recovery >90%. Assay validation showed that inter- and intra-day precision and accuracy were satisfactory. The method was applied to compare plasma CML levels in healthy Chinese subjects and patients with diabetes and uremia. In healthy subjects CML concentration (mean±SD) was 16.6±7.8 ng/mL. CML level in diabetic patients was not significantly different from healthy subjects whereas the level in patients with uremia was significantly higher than both healthy subjects and diabetic patients (P<0.001). The method will be useful to assess the value of CML as a biomarker of diabetic vascular complications resulting from elevated oxidative stress.