蛍光ベースの熱シフトアッセイは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ4の阻害剤を識別します

前立腺癌（PCA）は、米国の男性で2番目に高い癌死の原因です。PCA細胞の転移性の移動が阻害されると、PCAによる死亡率が大幅に減少する可能性があります。マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ4（MAP2K4）は、以前にヒトPCAの侵入促進シグナル伝達経路を活性化することが示されています。MAP2K4が新規で検証された治療標的を表していることを認識して、MAP2K4を標的とする小分子の識別のための効率的なプロセスを開発し、特徴付けようとしました。蛍光ベースの熱シフトアッセイ（FTS）アッセイを使用して、最初に既知のキナーゼ阻害剤の80の化合物ライブラリを評価し、それにより、濃度依存的にMAP2K4を熱安定化した8ヒットを特定しました。次に、キナーゼ阻害機能を評価するために、生物学的に関連する下流基質JNK1およびP38 MAPKを使用したin vitro MAP2K4キナーゼアッセイを開発しました。この方法で、最初のFTS画面のパフォーマンスを検証しました。次に、このアプローチを2000年の化合物化学的に多様なライブラリに適用し、7ヒットを特定し、in vitroキナーゼアッセイでそれらを確認しました。最後に、構造活性関係データをMAP2K4の結晶構造に結合することにより、リガンド結合のモデルを構築しました。特定された阻害化合物のATP結合ポケットへの結合を予測します。ここでは、新しい強力なMAP2K4阻害剤の発見と設計を通知する機能を備えた、堅牢な阻害剤スクリーニングプラットフォームの作成を報告します。

Prostate cancer (PCa) is the second highest cause of cancer death in United States males. If the metastatic movement of PCa cells could be inhibited, then mortality from PCa could be greatly reduced. Mitogen-activated protein kinase kinase 4 (MAP2K4) has previously been shown to activate pro-invasion signaling pathways in human PCa. Recognizing that MAP2K4 represents a novel and validated therapeutic target, we sought to develop and characterize an efficient process for the identification of small molecules that target MAP2K4. Using a fluorescence-based thermal shift assay (FTS) assay, we first evaluated an 80 compound library of known kinase inhibitors, thereby identifying 8 hits that thermally stabilized MAP2K4 in a concentration dependent manner. We then developed an in vitro MAP2K4 kinase assay employing the biologically relevant downstream substrates, JNK1 and p38 MAPK, to evaluate kinase inhibitory function. In this manner, we validated the performance of our initial FTS screen. We next applied this approach to a 2000 compound chemically diverse library, identified 7 hits, and confirmed them in the in vitro kinase assay. Finally, by coupling our structure-activity relationship data to MAP2K4's crystal structure, we constructed a model for ligand binding. It predicts binding of our identified inhibitory compounds to the ATP binding pocket. Herein we report the creation of a robust inhibitor-screening platform with the ability to inform the discovery and design of new and potent MAP2K4 inhibitors.