角膜上皮の再生と血清およびフィーダーセルを含まない培地で生成された結膜上皮同等物

目的：眼表面再建のための代替の自己組織は、両側性核幹細胞欠乏症の患者の潜在的な治療法です。患者の再生手順を目的として、非人間の血清やフィーダー細胞などの異種成分の関与を排除することが望ましい。本研究では、脱と上皮化された核角膜表面に移植されたときに血清および3T3フリーの培養条件で生成された培養接続詞上皮シートの挙動と表現型の特徴を調べました。 方法：中性プロテアーゼ消化によって得られた正常な結膜からの上皮細胞は、血清を含まない低カルシウム培地の培養によって拡大し、14日間空気液体界面培養に設定しました。結果として生じる多層上皮シートは、アルカリ処理によって上皮を含まないウサギ眼の表面に接ぎ木されました。事前に移植された閉鎖後上皮は、電子顕微鏡検査と免疫組織化学によって分析されました。 結果：移植時に、培養された上皮シートは、CK19（+）/MUC5AC（+）/CK3（ - ）/CK12（ - ）表現型を示す適切に層状の上皮の6-8層で構成されていました。Xeno-Graftingの2週間後、in vivoの上皮は、前駆細胞関連タンパク質P63、増殖マーカーKI67、デスモソーム、ヘミデスモソーム、およびそのインテグリン（β4）、および角膜特異的シトカーチンCK3、およびCK12を発現する5-6のよく圧縮された層で構成されていました。結膜ゴブレット細胞ムチン（MUC5AC）は見えませんでした。生着された上皮は、抗ヒト核抗体のために正に染色され、ウサギの角膜上の上皮細胞がヒト起源であることを確認しました。 結論：我々の結果は、血清および3T3フリーの培養条件で生成された結膜上皮シートが、in vivo角膜間質環境に移動すると角膜上皮表現型を獲得できることを示唆しています。

PURPOSE: An alternative autologous tissue for ocular surface reconstruction is a potential treatment for the patients with bilateral limbal stem cell deficiency. For the purpose of regenerative procedures in patients, it is desirable to eliminate the involvement of xenogeneic components, such as nonhuman sera and feeder cells. In the present study, we examined the behavior and phenotypic features of cultured conjunctival epithelial sheets generated in serum- and 3T3-free culture conditions when transplanted into the de-epithelialized limbal corneal surface. METHODS: Epithelial cells from normal conjunctiva obtained by neutral protease digestion were expanded by culture in a serum-free low-calcium medium and set in an air-liquid interface culture for 14 days. The resulting multilayered epithelial sheets were grafted onto rabbit ocular surfaces made epithelial-free by alkali treatment. Pre-grafted and post-grafted epithelia were analyzed by electron microscopy and immunohistochemistry. RESULTS: At graft time the cultured epithelial sheet consisted of 6-8 layers of properly stratified epithelium that displayed a CK19(+)/MUC5AC(+)/ CK3 (-)/CK12(-) phenotype, consistent with the conjunctival epithelial lineage. Two weeks after xeno-grafting the in vivo epithelium consisted of 5-6 well compacted layers expressing the precursor cell-related protein p63, the proliferation marker Ki67, desmosomes, hemidesmosomes and its integrin (β4), and the corneal specific cytokeratins CK3, and CK12. Conjunctival goblet cell mucin (MUC5AC) was not visible. The engrafted epithelium stained positively for the anti-human nuclei antibody, confirming that the epithelial cells on the rabbit corneas were of human origin. CONCLUSIONS: Our results suggest that conjunctival epithelial sheets generated in serum- and 3T3-free culture conditions can acquire the corneal epithelial phenotype when transferred to the in vivo corneal stromal environment.