CRISPRを介したゲノム編集のためのin vitroおよびin vivoでのリボザイムフランクRNAのガイドRNAへの自己処理

CRISPR/Cas9は、ガイドRNA（GRNA）分子を使用して配列固有のDNA切断を実行し、多くの生物でのゲノム編集に広く使用されています。GRNAの両端での変更は、多くの場合、Cas9/GRNAを非アクティブにします。これまでのところ、in vivoでのGRNAの産生は、U6およびU3 SnRNAプロモーターを使用することによってのみ達成されてきました。ただし、U6およびU3プロモーターには、細胞の特異性の欠如やin vitro転写の不適格性などの大きな制限があります。ここでは、in vitroとin vivoの両方でGRNAを効率的に生成するための多用途の方法を提示します。RGRという名前の人工遺伝子を設計します。これは、転写されると、設計されたGRNAの両端にリボザイム配列を持つRNA分子を生成します。RGRの一次転写産物が自己触媒切断を受けて、in vitroおよび酵母の両方でDNA標的の配列固有の切断を効率的に導くことができる、目的のGRNAを生成できることを示します。RGRは任意のプロモーターから転写できるため、適切なプロモーターが選択されている場合は、細胞および組織特異的なゲノム編集を可能にします。CRISPRによって生成された突然変異の検出は、多くの場合、酵素消化によって達成されますが、これはハイスループット分析とあまり互換性がありません。私たちのシステムにより、ユニバーサルプライマーを使用してin vitroで任意のGRNAを生成します。これは、Cas9タンパク質で使用してGRNA/CRISPRによって引き起こされる変異を検出できます。結論として、特定の細胞と組織で標的変異を生成し、生成された変異を効率的に検出するための多用途の方法を提供します。

CRISPR/Cas9 uses a guide RNA (gRNA) molecule to execute sequence-specific DNA cleavage and it has been widely used for genome editing in many organisms. Modifications at either end of the gRNAs often render Cas9/gRNA inactive. So far, production of gRNA in vivo has only been achieved by using the U6 and U3 snRNA promoters. However, the U6 and U3 promoters have major limitations such as a lack of cell specificity and unsuitability for in vitro transcription. Here, we present a versatile method for efficiently producing gRNAs both in vitro and in vivo. We design an artificial gene named RGR that, once transcribed, generates an RNA molecule with ribozyme sequences at both ends of the designed gRNA. We show that the primary transcripts of RGR undergo self-catalyzed cleavage to generate the desired gRNA, which can efficiently guide sequence-specific cleavage of DNA targets both in vitro and in yeast. RGR can be transcribed from any promoters and thus allows for cell- and tissue-specific genome editing if appropriate promoters are chosen. Detecting mutations generated by CRISPR is often achieved by enzyme digestions, which are not very compatible with high-throughput analysis. Our system allows for the use of universal primers to produce any gRNAs in vitro, which can then be used with Cas9 protein to detect mutations caused by the gRNAs/CRISPR. In conclusion, we provide a versatile method for generating targeted mutations in specific cells and tissues, and for efficiently detecting the mutations generated.