コーティングされた小胞プロトンポンプの阻害と、N、N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドによる17,000-ダルトンポリペプチドの標識

n、n'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCCD）は、クラスリンコーティングされた小胞におけるプロトン輸送の100％および（mg2+） - ATPase活性の80〜85％を阻害します。30分後に10ミクロムDCCDでプロトン輸送の半分の阻害が観察されます。コーティングされた小胞（H+）-DCCDによるATPaseの処理は、界面活性剤溶解状態でのATP加水分解に影響を与えませんが、プロトン輸送の感度とDCCDへのATPase活性は、リン脂質小胞への再構成後に回復します。さらに、DCCDによる洗剤溶解酵素の治療に続いて再構成が続くと、プロトン輸送とATP加水分解の両方でブロックされる準備が得られます。これらの結果は、コーティングされた小胞（H+） - ATPaseは、膜結合または洗剤溶解状態のいずれかでDCCDと反応することができることを示唆していますが、ATPase活性の阻害は、ポンプが密閉膜小胞に存在する場合にのみ現れます。コーティングされた小胞（H+） - DCCDによるATPaseの阻害の原因となるサブユニットを特定するために、[14C] DCCDで部分的に精製された酵素を標識しました。分子量17,000の単一のポリペプチドに標識されています。このポリペプチドの非常に疎水性の性質は、クロロホルムであるメタノールによる抽出によって示されています。17,000-ダルトンタンパク質は、0.15-0.20 molのDCCD/mol ofタンパク質の化学量論で発生するプロトン輸送の100％阻害で、0.99 molのDCCD/molのタンパク質の最大化学量論に標識できます。クロロホルムのアミノ酸分析：メタノール抽出された17,000-ダルトンポリペプチドは、非極性アミノ酸の高い割合を明らかにしています。このタンパク質の特性とカップリング因子（H+）-ATPaseのDCCD結合サブユニットの類似性は、17,000ダルトンポリペプチドがコーティングされた小胞プロトンポンプのプロトンチャネルの一部として機能する可能性があることを示唆しています。

N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCCD) inhibits 100% of proton transport and 80-85% of (Mg2+)-ATPase activity in clathrin-coated vesicles. Half-maximum inhibition of proton transport is observed at 10 microM DCCD after 30 min. Although treatment of the coated vesicle (H+)-ATPase with DCCD has no effect on ATP hydrolysis in the detergent-solubilized state, sensitivity of proton transport and ATPase activity to DCCD is restored following reconstitution into phospholipid vesicles. In addition, treatment of the detergent-solubilized enzyme with DCCD followed by reconstitution gives a preparation that is blocked in both proton transport and ATP hydrolysis. These results suggest that although the coated vesicle (H+)-ATPase can react with DCCD in either a membrane-bound or detergent-solubilized state, inhibition of ATPase activity is only manifested when the pump is present in sealed membrane vesicles. To identify the subunit responsible for inhibition of the coated vesicle (H+)-ATPase by DCCD, we have labeled the partially purified enzyme with [14C]DCCD. A single polypeptide of molecular weight 17,000 is labeled. The extremely hydrophobic nature of this polypeptide is indicated by its extraction with chloroform:methanol. The 17,000-dalton protein can be labeled to a maximum stoichiometry of 0.99 mol of DCCD/mol of protein with 100% inhibition of proton transport occurring at a stoichiometry of 0.15-0.20 mol of DCCD/mol of protein. Amino acid analysis of the chloroform:methanol extracted 17,000-dalton polypeptide reveals a high percentage of nonpolar amino acids. The similarity in properties of this protein and the DCCD-binding subunit of the coupling factor (H+)-ATPases suggests that the 17,000-dalton polypeptide may function as part of a proton channel in the coated vesicle proton pump.