植物ゲノムエンジニアリング用のDNAレプリコン

シーケンス固有のヌクレアーゼにより、より高い真核生物のゲノムDNAの容易な編集が可能になります。ただし、植物細胞にゲノムエンジニアリングを提供するための試薬を送達するための効果のない方法により、植物ゲノムの標的修飾は依然として困難です。ここでは、ジェミニビルスベースのレプリコンを使用して、配列特異的ヌクレアーゼ（亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、および定期的に互いに散在する短いパリンドローム反復系）およびDNA修復テンプレートの送達を一時的に発現するために使用します。タバコ（Nicotiana Tabacum）では、豆の黄色のd星ウイルスに基づいたレプリコンは、従来のAgrobacterium tumefaciens T-DNAよりも1〜2桁の頻度を標的とする遺伝子を強化しました。ヌクレアーゼを介したDNA二本鎖切断に加えて、遺伝子ターゲティングは、ゲミニビロス複製イニシエータータンパク質の修復テンプレートの複製と多面的活性によって促進されました。Geminivirus Repliconsを使用して、望ましいDNA配列修飾を備えた植物を生成する可能性を実証します。一般的な植物形質転換法を採用することにより、希望のDNA変化を伴う植物は6週間未満で再生されました。これらの結果は、ゲミニビロスの大規模な宿主範囲に加えて、植物ゲノム工学のためにレプリコンの使用を提唱しています。

Sequence-specific nucleases enable facile editing of higher eukaryotic genomic DNA; however, targeted modification of plant genomes remains challenging due to ineffective methods for delivering reagents for genome engineering to plant cells. Here, we use geminivirus-based replicons for transient expression of sequence-specific nucleases (zinc-finger nucleases, transcription activator-like effector nucleases, and the clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat/Cas system) and delivery of DNA repair templates. In tobacco (Nicotiana tabacum), replicons based on the bean yellow dwarf virus enhanced gene targeting frequencies one to two orders of magnitude over conventional Agrobacterium tumefaciens T-DNA. In addition to the nuclease-mediated DNA double-strand breaks, gene targeting was promoted by replication of the repair template and pleiotropic activity of the geminivirus replication initiator proteins. We demonstrate the feasibility of using geminivirus replicons to generate plants with a desired DNA sequence modification. By adopting a general plant transformation method, plantlets with a desired DNA change were regenerated in <6 weeks. These results, in addition to the large host range of geminiviruses, advocate the use of replicons for plant genome engineering.